Andamiajes poliméricos obtenidos por electrohilado y espumado supercrítico para regeneración de tendón y hueso

Abstract

La ingeniería de tejidos ha experimentado una intensa evolución orientada a hacer frente a la creciente demanda de restauración o reemplazo de tejidos que han sufrido daños estructurales o funcionales. Para inducir y guiar el crecimiento del tejido, se combinan tres herramientas: andamiajes porosos o scaffolds que proporcionan una estructura de soporte mecánico; células o biomoléculas que atraen células del hospedador hacia el scaffold; y factores de crecimiento que regulan la diferenciación y la funcionalidad de las células. Cada año se producen más de treinta millones de lesiones de tendón en el mundo y, aproximadamente, una de cada diez personas sufre una tendinopatía (dolor recurrente con posible daño o inflamación) antes de los 45 años. Estas cifras son cinco veces superiores en los deportistas. El tendón está constituido por fibras, cuyo componente principal es el colágeno, alineadas en estructuras capaces de hacer frente a las tensiones mecánicas que tiene que soportar este tejido. La menor vascularización y la más baja densidad celular de los tendones, en comparación con otros tejidos, determinan que, cuando se produce una lesión, la recuperación de la funcionalidad resulte difícil. La reparación tisular es lenta y el tejido que se forma no tiene las mismas propiedades mecánicas que el original, por lo que es frecuente que se reproduzcan las lesiones. La técnica de electrospinning permite obtener estructuras fibrosas implantables con una morfología que se adapta al lugar de implantación, lo que las dota de un gran potencial como integrantes de scaffolds para la regeneración de tejidos como la piel, el músculo y el tendón. A diferencia de otros tejidos, el hueso tiene capacidad para regenerarse completamente sin dejar cicatriz si el tamaño de la lesión no supera un valor límite (defecto crítico). Circunstancias como un aporte sanguíneo deficiente, infecciones bacterianas o enfermedades sistémicas tienen también una influencia negativa sobre la capacidad regenerativa. Los andamiajes deben reproducir la estructura altamente porosa y la elevada resistencia mecánica del hueso, al tiempo que deben permitir la colonización celular y la formación de nuevo tejido. No obstante, reproducir las características microestructurales y mecánicas del hueso sigue siendo un reto. Recientemente se ha introducido la técnica de fluidos supercríticos para procesar materiales tanto orgánicos como inorgánicos y obtener estructuras con tamaño, resistencia mecánica y porosidad controladas, que ofrecen interesantes posibilidades como scaffolds. El CO2 supercrítico tiene propiedades intermedias entre las de los líquidos (alta densidad) y las de los gases (alta difusividad, baja viscosidad y muy baja tensión superficial), lo que lo hace muy adecuado para preparar implantes bajo condiciones suaves y en ausencia de disolventes orgánicos. La tesis doctoral se planteó con el objetivo general de desarrollar dos tipos de sistemas implantables constituidos por armazones poliméricos y con factores de crecimiento plaquetario incorporados: scaffolds nanofibrosos para regeneración de tendón aplicando técnicas de electrospinning; y scaffolds rígidos porosos para regeneración de tejido óseo implementando procedimientos de espumado con CO2 supercrítico. El interés por el empleo de plasma rico en plaquetas (PRP) y sus análogos liofilizados (PRGF, preparación rica en factores de crecimiento) como fuentes de factores de crecimiento autólogos (en proporciones fisiológicas) se ha incrementado en los últimos años, una vez que se ha demostrado su capacidad para regenerar tejidos mediante la activación del complemento y la inducción de cambios en la microvasculatura. Desde un punto de vista tecnológico, la incorporación de PRP o PRGF a mallas de electrohilado o a scaffolds procesados por espumado supercrítico, para obtener materiales que combinen buenas prestaciones como soportes estructurales y como materiales bioactivos, representa un reto. De hecho, las publicaciones en las que se aborda la incorporación de PRP a fibras son todavía escasas y no se ha descrito ningún procedimiento para su inclusión en andamiajes procesados en condiciones supercríticas. Con las investigaciones planteadas en esta Tesis se pretende generar información útil para desarrollar scaffolds en los que los factores de crecimiento mantengan su actividad y desde los que se puedan ceder para promover eficazmente la regeneración tisular. Se prepararon y evaluaron los siguientes sistemas: 1. Mallas de electrohilado constituidas por fibras de poli-ε-caprolactona (PCL) y funcionalizadas en superficie con plasma rico en plaquetas (PRP) aplicando un procedimiento de recubrimiento por impregnación/liofilización. La hipótesis de partida fue que el PRP puede incrementar la adhesión y la proliferación celular sin detrimento de las propiedades mecánicas de los scaffolds. Una cesión sostenida de factores de crecimiento desde las fibras recubiertas con PRP debe crear un ambiente propicio para estimular la regeneración del tejido. Esta parte del trabajo se llevó a cabo en colaboración con el grupo de Javier Macossay de la Universidad Texas-PanAm (Estados Unidos). El recubrimiento de las mallas con PRP por impregnación seguida de liofilización no modificó los valores de módulo de Young, pero dio lugar a una pequeña reducción de la tensión de rotura y de la tensión de deformación. Las mallas recubiertas mostraron una hidrofilia mucho más elevada y dieron lugar a una cesión relativamente rápida de factores de crecimiento. En cultivos con células madre mesenquimales se observó un incremento de la adhesión y la proliferación celular, sin sobre-expresión de marcadores de diferenciación celular, con respecto a las mallas sin recubrir. Los ensayos de proliferación vascular, utilizando membrana corioalantoidea de huevo de gallina fecundado, revelaron que las mallas recubiertas con PRP inducen la formación de un gran número de vasos sanguíneos, que surgen, se ramifican y, en algunos casos, crecen en el interior de las mallas. En su conjunto, estos resultados prueban que la impregnación de mallas electrohiladas de PCL con PRP conduce a la obtención de scaffolds en los que los factores de crecimiento mantienen su actividad. La creación de un ambiente extracelular rico en factores de crecimiento hace que las mallas recubiertas tengan una mayor capacidad de adhesión y de proliferación celular, manteniendo el linaje de las células. Además, las mallas de PCL-PRP favorecen la angiogénesis en el lugar de implantación. Desde un punto de vista práctico, el procedimiento en dos etapas que se ha implementado tiene la ventaja de que las mallas se pueden preparar con antelación e impregnarlas inmediatamente antes de su uso utilizando PRP procedente de sangre del propio paciente. 2. Mallas de electrohilado con fibras alineadas o con disposición al azar combinando ácido poli-L-láctico (PLLA) y factores de crecimiento procedentes de PRP (preparación rica en factores de crecimiento, PRGF). El objetivo de esta parte de la tesis fue investigar el posible efecto sinérgico de la orientación de las fibras y la cesión de factores de crecimiento sobre la regeneración de tejidos que, como los tendones, presentan una estructura anisotrópica. Para llevar a cabo el estudio, se prepararon scaffolds con proporciones crecientes de PRGF y se hizo un seguimiento de la adhesión y la proliferación de células mesenquimales. Esta parte del trabajo se llevó a cabo en colaboración con el grupo de Gustavo Abraham de la Universidad Nacional de Mar del Plata (Argentina). Las mallas se prepararon por electrospinning de disoluciones de PLLA y PRGF en DCM:DMF (60:40 v/v). Para obtener mallas con fibras distribuidas de manera aleatoria se utilizó un colector de base fija. Las mallas con fibras alineadas se obtuvieron colocando sobre el colector dos placas dieléctricas que forzaron la deposición de las fibras en el espacio libre entre ellas. La incorporación de PRGF a las nanofibras dio lugar a un marcado incremento en su hidrofilia y favoreció la adhesión y la proliferación celular. Todas las mallas controlaron eficazmente la cesión de factores de crecimiento durante al menos 21 días. Las células incubadas sobre mallas de fibras dispuestas al azar no mostraron una orientación específica, a diferencia de las células sembradas sobre fibras alineadas, en las que se observó la elongación de los citoplasmas en la dirección de las fibras. Estos resultados prueban que el electrohilado del PRGF aplicando el procedimiento que se ha desarrollado no conduce a la inactivación de los factores de crecimiento. La incorporación de PRGF y la orientación de las fibras se muestran como herramientas útiles para diseñar mallas de electrohilado con prestaciones versátiles en regeneración de tejidos con diferentes morfologías. 3. Scaffolds porosos de PCL, almidón y PRGF procesados mediante técnicas de fluidos supercríticos. El objetivo de esta parte de la Tesis fue combinar las propiedades estructurales y de biodegradación lenta de la PCL, con la capacidad del almidón para incrementar la hidrofilia del scaffold, gelificar y actuar como agente regulador de la cesión de factores de crecimiento. Esta aproximación encierra una notable novedad dado que no se han encontrado en la bibliografía referencias al procesado por técnicas de fluidos supercríticos de factores de crecimiento liofilizados. Para llevar a cabo el trabajo, se planteó la preparación de mezclas con distintas proporciones de los tres componentes (previa gelificación del almidón) y la implementación de un procedimiento de espumado supercrítico en condiciones suaves, dirigido a obtener scaffolds porosos de morfología similar a la del hueso esponjoso, sin causar la desnaturalización de los factores de crecimiento. La tecnología de CO2 supercrítico encierra, entre otras, la ventaja de que, sin necesidad de incorporar disolventes orgánicos, el CO2 permite reducir las temperaturas de transición vítrea y de fusión de la PCL (59-64 ºC), facilitando el procesado a temperaturas compatibles con la estabilidad de moléculas lábiles. Mezclas de PCL, almidón pulverizado y PRGF (obtenido por liofilización de PRP humano activado mediante ciclos de congelación y descongelación) se introdujeron en bolsas de papel de filtro (3 x 2 cm) y se sometieron a espumado supercrítico a 37 ºC y 100 bar durante 30 min para obtener los scaffolds en una sola etapa. La despresurización del reactor a 15 bar/min condujo a la formación de una estructura en forma de panal de abeja, con poros homogéneamente distribuidos y de tamaño comprendido entre 50 y 200 μm y una porosidad total comprendida entre 51 y 64%. El análisis de la actividad biológica del PRGF tras el espumado supercrítico dio lugar a valores superiores al 90% con respecto a la muestra sin procesar. El análisis reológico de los scaffolds mostró que todos ellos presentan módulos elástico y viscoso del orden de 108 y 107 Pa, respectivamente, lo que concuerda con resultados encontrados previamente con otros sistemas implantables. La incorporación de almidón gelificado resultó en un mejor control del proceso de cesión de los factores de crecimiento, si bien todos los scaffolds conteniendo PRGF promovieron la adhesión y la proliferación de células madre mesenquimales. En suma, el procedimiento de espumado supercrítico puesto a punto en esta parte de la tesis para preparar scaffolds de PCL permite incorporar factores de crecimiento autólogos sin detrimento de su actividad biológica. Además, la incorporación de almidón pregelificado ofrece la posibilidad de regular el perfil de cesión de los factores de crecimiento, adaptándolo a las necesidades de adhesión y proliferación celular. 4. Scaffolds porosos de mezclas de PCL, PLGA de baja viscosidad inherente y factores de crecimiento procesados por espumado subcrítico. Se planteó el desarrollo de un implante poroso con velocidad de biodegradación relativamente rápida y adaptada a la velocidad de regeneración del hueso, utilizando una variedad de PLGA de bajo peso molecular (15 KDa; viscosidad inherente 0,2 dL/g). Para ello, se puso a punto un método de espumado en condiciones subcríticas (presión y temperatura por debajo del punto crítico), con el fin de evitar la expansión incontrolada del copolímero que es característica de su procesado en condiciones supercríticas. El procedimiento puede servir también para superar otras limitaciones propias del procesado de polímeros sintéticos de baja viscosidad inherente, como las relacionadas con el control de la morfología y la reproducibilidad de las propiedades de los scaffolds. Como componentes adicionales de los scaffolds, se utilizaron PRGF y almidón pregelificado a 90 ºC y secado en estufa a 80 ºC o liofilizado. Esta parte del trabajo se llevó a cabo en colaboración con el grupo de John Jansen de la Radboud University (Países Bajos). Para preparar los scaffolds, se mezclaron los componentes sólidos y se procedió a su compactación en una máquina de comprimir dotada de punzones y matrices de sección rectangular (14x10 mm). Los comprimidos resultantes se procesaron en condiciones subcríticas (60 bar, 27 ºC, 30 min, despresurización 5 bar/min) en una sola etapa. Tras el procesado subcrítico, los scaffolds de PCGL mostraron un volumen hasta cuatro veces superior al del comprimido de partida (165-318%). Los perfiles de cesión mostraron un burst en las primeras horas, producido por el PRGF presente en la superficie de los scaffolds y en las paredes de los poros directamente expuestas al medio de disolución, al que siguió una fase de cesión más lenta, controlada por la velocidad de degradación de la matriz polimérica. La presencia de almidón pregelificado en la formulación aceleró la cesión de los factores de crecimiento, debido a la mayor capacidad de captación de agua de los scaffolds. Una vez más, la presencia de PRGF en los scaffolds dio lugar a incrementos significativos de la adhesión y la proliferación de células mesenquimales en los scaffolds. 5. Scaffolds porosos de mezclas de PCL, fibroína de seda e hidroxiapatita preparados por espumado supercrítico para regeneración ósea. En la última etapa de la tesis, se planteó un estudio dirigido a mejorar las prestaciones de los scaffolds de PCL, incrementando su hidrofilia y su degradabilidad, mediante la incorporación de fibroína de seda, un material biocompatible, con propiedades mecánicas y velocidad de degradación similar a la de regeneración ósea. Con el fin de mejorar la osteoconductividad y favorecer la formación de hueso, se incorporó a los scaffolds hidroxiapatita de tamaño de partícula nanométrico (nHA), que puede evitar problemas derivados de una erosión excesivamente lenta y acelerar la formación de depósitos extracelulares de calcio. Esta parte del trabajo se llevó a cabo en colaboración con los grupos de John Jansen de la Radboud University (Países Bajos), Carmen Évora de la Universidad de La Laguna, y José Luis Cenís del Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario (IMIDA). Para preparar los scaffolds, se partió de mezclas binarias y ternarias de PCL, fibroína y nHA, que se procesaron con CO2 en condiciones supercríticas (37 ºC, 100 bar durante 60 min). Para favorecer la formación de poros homogéneos, se efectuó la despresurización a 3 bar/min. Los scaffolds resultantes mostraron una estructura muy porosa, con poros de un tamaño comprendido entre 100 y 200 μm, y módulo de compresión similar al del hueso esponjoso. Los scaffolds de PCL-Fibroína-nHA presentaron una hidrofilia elevada y adhesión y proliferación celular mejoradas. Además, favorecieron la formación de depósitos de calcio en la matriz extracelular. En resumen, los resultados obtenidos mostraron que el espumado supercrítico de PCL, fibroína y nHA da lugar a scaffolds que ofrecen sinergias en lo que se refiere a hidrofilia, adhesión de células preosteoblásticas y mineralización ósea.