Cambios estructurales en agregados pre-amiloidogénicos del dominio SH3 de α-espectrina (structural changes in pre-amyloidogenic aggregates of the SH3 domain of α-spectrin)

Abstract

Las amiloidosis y enfermedades relacionadas, como el Alzheimer y el Parkinson, se caracterizan por la presencia en los tejidos de depósitos de agregados insolubles de naturaleza proteica, en forma de fibras amiloides. El mecanismo de agregación amiloidea no se encuentra el todo explicado, aunque el más aceptado para explicar la formación de las fibras amiloides consiste en un proceso de nucleación-extensión, con una inicial formación de oligómeros, cuyos crecimiento termina con la formación de fibras maduras. Además, experimentos in vitro han demostrado que la formación de fibras amiloides es un fenómeno general de cualquier proteína, no solo de aquellas relacionadas con enfermedades, justificando el uso de proteínas modelos en el estudios de la agregación amiloides. Este proyecto de tesis se centra en el estudio, utilizando metodologías de fluorescencia de moléculas individuales (SMF), de las etapas iniciales de formación de las especies oligoméricas pre-fibrilares del mutante N47A del dominio Spc-SH3. El empleo de metodologías de SMF al estudios de las estructuras, de los procesos y de la heterogeneidad de estas especies oligoméricas, ha permitido en los últimos años de afrontar las dificultades ínsitas a sus caracterización frente a técnicas que solo permiten estudiar las moléculas a nivel de conjunto. Debido al desarrollo sólo reciente de estas nuevas técnicas, las aplicaciones de SMF en estudios de fibras amiloides, hasta la fecha, son pocas. En esta Tesis nos hemos propuesto un estudio multidisciplinar para caracterizar los oligómeros formados durante las primeras fases de la agregación amiloides. Este ha incluido el uso de novedosas metodología de fluorescencia de moléculas individuales con un esquema de excitación pulsada alternante (SMF-PIE) y técnica de imágenes de tiempos de vida de fluorescencia (FLIM-PIE), corroborando y complementando los resultados obtenidos en los estudios de moléculas individuales mediante técnicas biofísicas convencionales como calorimetría diferencial de barrido (DSC), dicroísmo circular (CD), dispersión dinámica de luz (DLS). La espectroscopia de fluorescencia de moléculas individuales permite la detección ultra-sensible y cuantificación de interacciones entre las moléculas, permitiendo acceder a informaciones sobre la cinética de agregación, el tamaño de oligómeros, y determinaciones de poblaciones relativas de los distintos tamaños. Por primera vez la cuantificación del tamaño de los oligómeros ha sido obtenida considerando la influencia del quenching a la intensidad de fluorescencia del dador, que constituye un avance en el análisis respecto a estudios anteriores. Estas informaciones precisas de tamaño de oligómeros y FRET nos han permitido distinguir 3 distintos tipos de oligómeros formados durante la agregación de la proteína etiquetada. Hemos diferenciado un tipo 1 de oligómeros, de baja-FRET y tamaño entre 2 – 8 monómeros, un tipo 2 que incluye oligómeros de alta-FRET y tamaño comparable al tipo 1, y un tipo 3, de alta-FRET y mayor tamaño, cronológicamente posterior a la formación del tipo 2. Se ha caracterizado termodinámicamente el primer equilibrio de oligomerización entre monómeros y dímeros, estudiados sin incubar las muestras y realizando los experimentos a baja concentración (pM). El valor de la constante de equilibrio de disociación de los dímeros resultó ser de 10 nM, indicando la estabilidad de estos primeros oligómeros. Estos resultados han constituido una consolidación experimental de los modelos teorizados mediante estudios computacionales que han demostrado la importancia de las interacciones no específicas en el mecanismo de formación de fibras amiloides, a concentraciones de proteínas fisiológicamente relevantes. El desarrollo del estudio se ha centrado posteriormente en la cinética de oligomerización y se han estudiado los procesos cruciales del mecanismo de formación de los tres tipos de oligómeros identificados. La nueva corrección aportada al cálculo del tamaño aparente de los oligómeros por el tiempo de vida de fluorescencia de los oligómeros, ha permitido la cuantificación individual de los oligómeros, el seguimiento de sus evoluciones con el tiempo y de extraer los órdenes de reacción de los procesos claves de la formación de las distintas especies. La cinética de formación de los oligómeros de tipo 2 se ha justificado con la existencia de un cambio conformacional junto con la necesidad de encuentros bimoleculares que precede la evolución hacía especies oligoméricas más organizadas. La correlación de las cinéticas de los oligómeros de tipo 1 y tipo 3, que ha resultado ser para ambos de tercer orden, abre la posibilidad para los oligómeros de tipo 1 de obviar el cambio conformacional hacia el tipo 2, actuando los de tipo 3 como plantilla para el crecimiento hacia especies más grande y organizadas. Estudios de citotoxicidad efectuados para los tres tipos de oligómeros han demostrado que las especies más tóxicas son los oligómeros de tipo 2 y 3, identificando en estos oligómeros un target farmacológico para prevenir, al mismo tiempo, la agregación amiloidea y disminuir la toxicidad per se de estos oligómeros. En su conjunto, esta Tesis presenta un avance significativo, tanto en la metodología de cuantificación de los oligómeros como en la multidisciplinariedad utilizada en un estudio de formación de fibras amiloides. La identificación de los potenciales agentes implicados en el proceso de agregación y las técnicas de análisis desarrolladas para su precisa caracterización podrían tener importantes aplicaciones en otras proteínas relacionadas con las enfermedades y en el estudio de inhibidores de las primeras etapas del proceso de agregación.