Transcriptoma de las neuronas termosensiblescaracterización molecular y funcional en condiciones fisiológicas y en la neuropatía periférica inducida por el agente quimioterapéutico oxaliplatino

Resumen

El canal iónico TRPM8 (“Transient Receptor Potential Melastatin 8”) es el principal sensor del frío ambiental y se activa por descensos moderados de temperatura y compuestos refrescantes, como el mentol. En el sistema somatosensorial, el canal se expresa en un pequeño conjunto de neuronas sensoriales de pequeño tamaño donde determina un papel crucial en la detección del frío inocuo, aunque también se le ha relacionado con la detección del frío nocivo y la nocicepción. El uso de distintas líneas reporteras de ratones ha permitido caracterizar esta población neuronal, la cual no expresa los marcadores típicos de los nociceptores tales como CGRP o IB4. Además, se ha demostrado que, funcionalmente se distinguen dos tipos de neuronas sensibles al frío, un grupo que se activa por descensos suaves de la temperatura (neuronas de bajo umbral) y un segundo grupo que responde a temperaturas más bajas (neuronas de alto umbral). Estos estudios muestran, además, que las dos poblaciones presentan un patrón diferente en la expresión de marcadores nociceptivos, sugiriendo un papel fisiológico diferente en la transducción del frío inocuo y nocivo. Más recientemente, los estudios del transcriptoma también han encontrado diferencias moleculares entre las neuronas que expresan TRPM8, no obstante, no se ha podido relacionar con las dos clases identificadas funcionalmente. Por otro lado, se desconoce el papel de las neuronas TRPM8+ y los mecanismos genéticos alterados en el contexto del dolor patológico. El objetivo general de este trabajo ha sido la caracterización molecular de las neuronas TRPM8+ y su papel en la neuropatía periférica inducida por el agente quimioterapéutico oxaliplatino en un modelo murino, así como la identificación de posibles genes y mecanismos que desarrollen la sensibilidad al frío. Basamos nuestro estudio en el uso de técnicas de biología molecular y celular en un modelo reportero murino (la línea TRPM8BACEYFP), que permite identificar las neuronas TRPM8+ a través de una proteína fluorescente reportera. El primer objetivo de esta tesis doctoral ha sido estudiar el papel que juegan los canales TRPM8 y TRPA1 en los mecanismos de sensibilidad al frío en neuronas sensoriales. Para ello, realizamos experimentos de imagen de calcio in vitro en neuronas sensoriales disociadas procedentes de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), aplicando rampas de frío y agonistas químicos de los principales miembros de los TRPs. Los resultados de los experimentos muestran que la mayoría de las respuestas al frío están mediadas por TRPM8, aunque existe un pequeño porcentaje de respuestas dependientes de TRPA1. Asimismo, se comprobó que nuestro modelo transgénico identifica a dos poblaciones TRPM8+ con una expresión variable para este gen. Estas dos poblaciones presentan características morfológicas y funcionales distintas, incluyendo el umbral de activación por temperatura para el estímulo del frío. El segundo objetivo de esta tesis fue obtener el perfil transcriptómico, mediante de la secuenciación masiva de ARN (RNA-Seq), de neuronas TRPM8+ y IB4+ aisladas mediante citometría activada por fluorescencia (FACS). Una vez secuenciado el ARN, se compararon ambos perfiles moleculares e identificamos un conjunto de genes diferencialmente expresados en ambas poblaciones. Se demostró además que el perfil molecular de la población TRPM8+ identifica a un subgrupo de nociceptores denominados peptidérgicos. Tras comparar nuestro trabajo con otros estudios de transcriptómica realizados en células individuales y la posterior validación de un conjunto de genes seleccionados usando la técnica de hibridación in situ (RNAscope), descubrimos que los marcadores peptidérgicos identifican a un grupo de neuronas TRPM8+ de baja expresión para este gen. Estas neuronas corresponden al grupo de neuronas sensibles al frío de alto umbral identificado por fluorescencia en la línea TRPM8BACEYFP, por lo que este modelo constituye una buena herramienta para el estudio de estos nociceptores sensibles al frío. Por último, el objetivo final de tesis fue estudiar los cambios funcionales y moleculares en la sensibilidad al frío de las neuronas TRPM8+ y TRPA1+ en un modelo de dolor neuropático inducido por oxaliplatino. Este compuesto quimioterapéutico causa una neuropatía periférica caracterizada, entre otros síntomas, por su hipersensibilidad al frío. El desarrollo del modelo neuropático se evaluó a través de pruebas de conducta. Usando las mismas técnicas mencionadas para la condición fisiológica, demostramos que el oxaliplatino aumenta el número de neuronas sensibles en las poblaciones TRPM8+ y TRPA1+, alterando, además, su perfil genético. Las conclusiones del trabajo sugieren que la hipersensibilidad al frío inducida por la neuropatía puede estar causada por una sensibilización de un grupo de neuronas silentes TRPM8+ de baja expresión. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que las neuronas TRPM8+ presentan una heterogeneidad molecular y revela los mecanismos moleculares alterados en la neuropatía inducida por oxaliplatino, lo cual sugiere un papel en la nocicepción y detección del frío nocivo.