Purificacion, regulacion e inmovilizacion de la o-acetil-l-serina sulfhidrilasa del alga eucariotica chlamydomonas reinhardtii

Resumo

Se han separado y purificado dos isoenzimas con actividad o-acetil-l-serina sulfhidrilasa a partir de celulas de chlamydomonas reinhardtii, utilizando como etapa basica la cromatografia hidrofobica en fenil-sefarosa. La relacion de actividades oass1/oass2 es de 3 lo que sugiere que oass1 es la isoenzima basica en la sintesis de l-cisteina. Ambas isoenzimas muestran parametros cineticos similares y un peso molecular de 65.000, y se inhiben por los sustratos de la reaccion y por l-metionina, que se comporta como un inhibidor no competitivo con ki de 6,5 mm. Por otro lado, ambas isoenzimas se inhiben por hidroxilamina y amimooxiacetato lo que, junto con el espectro de absorcion con maximos a 280 y 390 nm, sugiere que contienen piridoxal-5-fosfato como grupo prostetico. La inhibicion por l-cisteina, que a una concentracion de 5 mm inhibe un 50% la actividad oass1 y no afecta a oass2 y la estimulacion de la actividad oass1 en celulas deficientes en azufre, en las que oass1/oass2 es de 10,6, sugieren una diferente regulacion para ambas isoenzimas. La sobreexpresion de oass1 parece estar reprimida por algun producto de la incorporacion de azufre, quizas la l-cisteina, y requiere la presencia de co2 y luz. Por otro lado, la carencia de azufre disminuye hasta un 40% la actividad fotosintetica y hasta un 50% el consumo de nitrato o nitrito de c. Reinhardtii. Ademas, celulas deficientes en azufre mostraron actividades nitrato y nitrito reductasa un 85% y un 50%, respectivamente, menores que las mostradas por celulas cultivadas con sulfato. Finalmente, la inmovilizacion de o-acetil-l-serina sulfhidrilasa altero su cinetica, respecto a o-acetil-l-serina, mostrando una dependencia sigmoidal y la nitrito reductasa inmovilizada mostro un menor valor de km aparente para ferredoxina reducida y una mayor estabilidad que la enzima soluble.