Influence of chromatin factors and DNA-RNA hybrids in the repair of replication-born DSBs

Resumo

La información genética debe estar almacenada de manera segura en la molécula de ADN. Sin embargo, el ADN está continuamente expuesto a daños que alteran su estructura y secuencia dando lugar al proceso conocido cómo inestabilidad genómica. La inestabilidad genómica se manifiesta de muchas formas entre las cuales se encuentran las mutaciones, inserciones, deleciones, variaciones en el número de cromosomas, reordenamientos cromosómicos, hiper-recombinación y pérdida de heterocigosidad. El ADN puede presentar muchos tipos de lesiones que dan lugar a inestabilidad genómica tales como sitios abásicos, entrecruzamiento entre cadenas del ADN, aductos del ADN y cortes en el ADN. Mientras la lesión más común en el ADN son los cortes o roturas de cadena sencilla, las roturas de cadena doble son menos frecuentes, pero extremadamente tóxicas para la célula. Aunque la inestabilidad genómica está asociada con el envejecimiento prematuro, el cáncer y diversas patologías neurológicas, también es fuente de diversidad genética y molecular y actúa como el motor de la evolución (Aguilera and García-Muse, 2013; Tubbs and Nussenzweig, 2017). La información genética debe ser replicada de manera correcta en cada división celular dando lugar a dos cromátidas hermanas idénticas. Fallos durante la replicación del ADN pueden dar lugar a inestabilidad genética. De hecho, la mayoría de mutaciones presentes en las células cancerígenas están asociadas a errores durante la replicación. Durante su avance la horquilla de replicación puede encontrar numerosos obstáculos que comprometen su integridad y pueden dar lugar a diferentes tipos de daños en el ADN incluyendo las roturas asociadas a la replicación (Gaillard et al., 2015). Estas roturas son reparadas preferentemente usando como molde la cromátida hermana gracias a la presencia de anillos de cohesina, unos complejos proteicos que abrazan ambas cromátidas permitiendo que se mantengan próximas físicamente (Cortés-Ledesma and Aguilera, 2006; González-Barrera et al., 2003; Johnson and Jasin, 2000; Kadyk and Hartwell, 1992). Los fallos en la recombinación entre cromátidas hermanas pueden resultar en recombinación con otras secuencias homólogas y dar lugar a inestabilidad genética (Cortez, 2019). La reparación de roturas de ADN asociadas a la replicación ocurre en distintos contextos de cromatina y transcripción. Algunos trabajos sugieren una conexión entre diferentes factores de la cromatina y la reparación de roturas asociadas a la replicación (Juhász et al., 2018; Muñoz-Galván et al., 2013a; Nakamura et al., 2019) y otros proponen que el estado de transcripción de la secuencia de ADN donde se produce una rotura influye en su forma de repararse (Aymard et al., 2014; Kim et al., 2007; Wei et al., 2015). Por otro lado, se ha observado que el ARN generado durante la transcripción puede hibridar de manera transitoria con el ADN molde formando híbridos de ADN-ARN en los sitios de rotura (Li et al., 2016; Ohle et al., 2016; Roy et al., 2010). En esta tesis, por tanto, nos propusimos estudiar el papel de los factores de la cromatina y los híbridos de ADN-ARN en la reparación de cortes asociados a la replicación en Saccharomyces cerevisiae. Para estudiar si la cromatina influye en la reparación de roturas asociadas a la replicación del ADN hemos analizado la eficiencia del proceso de recombinación entre cromátidas hermanas en una selección de mutantes de remodeladores de cromatina y modificadores de histonas. Hemos identificado dos complejos de desacetilasas de histonas, Rpd3L y Hda1 con un papel claro en la recombinación entre cromátidas hermanas. Para entender su mecanismo de acción hemos analizado dobles mutantes de cada uno de los genes junto con otros genes involucrados en este tipo de recombinación. Hay epistasia de rpd3 con una mutación en SCC1, el gen que codifica una de las subunidades de la cohesina, lo que sugiere que ambos genes participan en la misma ruta. Estos resultados concuerdan con la demostración de un defecto en la cohesión de las cromátidas hermanas en ausencia de Rpd3 o Hda1. Para explicar los resultados planteamos un modelo en el cual las desacetilasas de histonas Rpd3L y Hda1 facilitan la reparación de roturas de doble cadena asociadas a replicación promoviendo la cohesión entre las cromátidas hermanas. Para estudiar el papel de los híbridos de ADN-ARN en la reparación de roturas de ADN hemos analizado la capacidad de las células propagar un plásmido cortado (lineal). En condiciones de alta transcripción dichos plásmidos cortados se pierden a alta frecuencia en mutantes que acumulaban híbridos de ADN-ARN. Al analizar con detalle la eficiencia de reparación de estas roturas hemos observado que niveles elevados de híbridos de ADN-ARN interfieren con la reparación por recombinación independientemente de que la rotura se origina asociada al proceso de la replicación o directamente por acción endonucleolítica. Los datos apoyan un modelo en el cual los híbridos de ADN-ARN se acumulan en las roturas de doble cadena de ADN comprometiendo su reparación por recombinación e incrementado así la inestabilidad del genoma. Para la realización de ambos objetivos, durante esta tesis hemos desarrollado y validado una serie de sistemas de recombinación basados en la inducción de cortes en el ADN con la endonucleasa HO y con una versión mutada de la recombinasa “flipasa” (flp-H305L, FLPm). Esta última permite dirigir el corte de cadena sencilla a la cadena líder o rezagada con respecto a la replicación y a la transcrita o no transcrita, según el caso, responsable de la rotura de doble cadena asociada a replicación. En su conjunto, los resultados de esta tesis nos permiten concluir que la reparación de roturas de ADN asociadas a replicación se ve afectada tanto por el contexto cromatínico como el estado de transcripción del ADN en el que ocurre la rotura. En particular, hemos identificado un nuevo papel de las desacetilasas de histona Rpd3 y Hda1 en reparación por recombinación entre cromátidas hermanas que está mediado por su efecto en la cohesión entre las mismas y demostramos que los híbridos de ADN-ARN tienen un impacto negativo en la eficiencia de reparación de DSBs