Mecanismos de transglicosilación de disacaridasas del borde en cepillo (BBMV) del intestino delgado de cerdo.Purificación de lactulosa y galactosil lactulosas

Resumo

En la primera parte de esta tesis doctoral, se han desarrollado métodos sencillos de purificación de lactulosa y galactosil lactulosas presentes en mezclas complejas de carbohidratos, que permiten reducir la presencia de otros carbohidratos no prebióticos como son los monosacáridos y la lactosa. El tratamiento con carbón activo demostró ser un método rápido para fraccionar carbohidratos dependiendo de su grado de polimerización, permitiendo la eliminación total de monosacáridos y un 20% de disacáridos en una mezcla de galactosil lactulosas, utilizando agua como único solvente. La fermentación utilizando levadura (Saccharomyces cerevisiae) permitió la eliminación completa de monosacáridos sin ninguna pérdida de di- y oligosacáridos; sin embargo, además del etanol, se producen glicerol y alcoholes superiores difíciles de eliminar que limitan su uso como ingrediente alimentario. Por otro lado, se desarrolló un proceso simple para purificar lactulosa en jarabes de lactulosa comerciales mediante el estudio de la actividad enzimática, frente a la lactosa, lactulosa y epilactosa, de cuatro β-galactosidasas comerciales de origen microbiano. La β-galactosidasas de Bacillus circulans (Biolactasa® NTL * 2) y Bifidobacterium bifidum (Saphera® 2600 L) mostraron una baja actividad enzimática frente la lactulosa y una alta actividad enzimática frente la lactosa. Estas fueron elegidas para optimizar la hidrólisis enzimática de la lactosa utilizando la metodología de superficie de respuesta (RSM). El método propuesto ofrece un producto con alta pureza (> 94%) y alta recuperación (> 80%) de lactulosa. En la segunda parte de esta tesis se estudió la actividad transglicosidasa de las glicosidasas presentes en el extracto de las vesículas de la membrana del borde en cepillo (BBMV) del intestino delgado de cerdo mediante el uso de concentraciones suprafisiológicas de lactosa, lactulosa, sacarosa, isomaltulosa, trehalosa o maltosa con el objeto de conocer los mecanismos de transglicosilación que tienen lugar y de ese modo poder predecir el carácter prebiótico de distintos tipos de enlaces glicosídicos. Las reacciones de hidrólisis y transglicosilación dieron lugar a nuevos di- y trisacáridos que fueron caracterizados y cuantificados por GCMS y NMR. Cuando la lactosa y lactulosa se usaron como sustrato, la β-galactosidasa de BBMV pudo catalizar la síntesis de varios galactósidos con distintos enlaces β, tales como, los trisacáridos β-Gal-(1→X)- β-D-Gal-(1→4)-D-R (X = 1, 2, 3, 4) (R = Glc, Fru). Cuando se utilizaron sacarosa, maltosa o isomaltulosa como sustrato, las enzimas del BBMV catalizaron reacciones de hidrólisis y transglicosilación dando lugar a α-glucosil-fructosas y α-glucosil-glucosas unidas por enlaces α-(1→ 1, 2, 3, 4, 5, 6). Dado que la hidrólisis y la transglicosilación ocurren simultáneamente en el mismo sitio activo de la enzima, todos los enlaces nuevos formados durante la transglicosilación serán propensos a hidrolizarse en condiciones hidrolíticas. Estos resultados confirman que estas enzimas son capaces hidrolizar a más de un tipo de enlace, encontrándose cierta superposición en sus diversas actividades. El estudio de las reacciones de transglicosilación de disacáridos presentes en la dieta, llevado a cabo en esta tesis doctoral, ha permitido conocer las estructuras de los oligosacáridos sintetizados (es decir, tipos de enlaces glicosídicos, grado de polimerización y monosacáridos, que los constituyen) y que, por lo tanto, pueden ser susceptibles de ser hidrolizados por las disacaridasas del BBMV. La utilización de enzimas del extracto BBMV del intestino delgado de cerdo se propone como una estrategia válida para entender los mecanismos de la hidrólisis enzimática de los oligosacáridos de la dieta por parte de las disacaridasas del intestino delgado, permitiendo de esta forma el diseño de nuevos carbohidratos prebióticos.