Estudio de los complejos replicativos del virus de la bursitis infecciosa (IBDV) y análisis de la función de la proteína VP5

Resumo

El virus de la bursitis infecciosa (IBDV), un importante patógeno aviar responsable de una enfermedad inmunosupresora que afecta a pollos de gallina doméstica, es el miembro mejor estudiado de la familia Birnaviridae. Se trata de un virus icosaédrico desnudo cuyo genoma, formado por dos segmentos de RNA bicatenario, se encapsida en forma de complejos ribonucleoproteicos (RNPs) que incluyen el polipéptido VP3, que se une al dsRNA, y la RNA polimerasa (RdRp) viral. Esta característica, sumada a la ausencia de un núcleo transcripcional interno y a la existencia de numerosas características funcionales y estructurales similares a las observadas en virus RNA de cadena sencilla, sugieren que el programa de replicación de birnavirus podría exhibir diferencias significativas con respecto al modelo prototípico de virus dsRNA. En los últimos años se ha resuelto parcial o totalmente la estructura cristalográfica de todas las proteínas estructurales de IBDV y se han aportado muchos datos sobre el ensamblaje de la partícula viral utilizando como modelo de estudio Virus-like particles, VLPs. Sin embargo, muchos aspectos del ciclo de infección viral continúan siendo desconocidos. En esta memoria, se describe por primera vez un modelo celular para el ciclo de infección de IBDV, asociando las estructuras citoplasmáticas producidas por el virus con los procesos de transcripción/replicación, traducción y ensamblaje viral. Adicionalmente, se describe la importancia de las membranas intracelulares y el metabolismo lipídico y de colesterol durante el transcurso de la infección. Mediante técnicas de microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica, se ha abordado la caracterización de la distribución subcelular de cada una de las proteínas codificadas por el virus y se han caracterizado las estructuras resultantes que forman durante la infección. El análisis de la ultraestructura de células aviares infectadas por IBDV reveló la presencia de dos superestructuras contiguas en el citoplasma: i) agregados de viriones ordenados en forma de panal de abeja, denominados Paracrystalline Virus Arrays (PVAs); y ii) extensas áreas de aspecto electrondenso que desplazan cualquier componente celular, denominadas viroplasmas. Los centros de replicación viral se asocian a áreas del viroplasma con una alta concentración de RNPs, denominadas dominios de nucleación, donde se observó un reclutamiento activo del componente proteico de la cápsida, el polipéptido VP2. Por otro lado, el marcaje de viriones ensamblados se asoció con la presencia de focos citoplasmáticos traduccionalmente activos, lo que nos lleva a postular la traducción del genoma y el ensamblaje de la progenie viral como dos procesos que tienen lugar simultáneamente y en la misma localización del citoplasma. Finalmente, en estadios avanzados de infección los viroplasmas permanecen como remanentes del proceso replicativo, llegando a ocupar hasta dos terceras partes del volumen del citoplasma. Estas estructuras secuestran proteínas de respuesta inmune innata celular, como sensores citoplasmáticos de dsRNA y proteínas de respuesta a IFN (ISGs). En un segundo apartado, se han abordado diferentes aspectos de la función de la proteína no estructural VP5 utilizando un virus mutante carente de su expresión, IBDV KO VP5. Se ha estudiado el efecto de la expresión de una versión recombinante de la proteína flag-VP5. La acumulación de VP5 en la membrana plasmática se ha relacionado con el tráfico vesicular mediado por diferentes proteínas Rab y otras GTPasas pequeñas vinculadas al citoesqueleto, y con un incremento en la permeabilidad celular. Por último, se muestra un papel de VP5 como proteína antagonista de la producción de IFNβ en células infectadas por IBDV y como la ausencia de esta proteína en la infección repercute sobre los niveles de colesterol celular