Formación de dímeros pirimidínicos en el estado excitado tripleteCiclobutanos frente a fotoproductos (6,4).

Resumo

La radiación ultravioleta está asociada a la formación de ciertas lesiones en el ADN que están en el origen del cáncer piel. Entre las más relevantes se encuentran los daños que se producen en las bases pirimidínicas: dímeros ciclobutánicos (DCBs) y los fotoproductos (6,4) (6,4 PPs). Por ello se han realizado numerosos estudios para entender la fotoquímica implicada en su formación. Sin embargo, a pesar del extenso conocimiento mecanístico alcanzado, aún quedan algunos aspectos que necesitan ser clarificados. El objetivo general de esta tesis doctoral ha sido esclarecer algunos de los mecanismos de la fotorreacción del ADN, con especial atención a la formación de lesiones bipirimidínicas En primer lugar se estableció la influencia de la sustitución en C5 sobre las propiedades fotofísicas de 2-tiopirimidinas a través de estudios experimentales y cálculos teóricos. Para ello se escogieron 2-tiouracilo (TU), 2-tiotimina (TT) y 5-­tert-butiluracilo (BTU). Los espectros de UV registrados fueron similares para los tres compuestos. presentando un máximo sobre 275 nm y un hombro sobre 290 nm. Las tres 2-tiopirimidinas exhibieron también una intensa de fosforescencia, de 0.7, de cuyos espectros se determinaron las energías de sus estados excitados tripletes: 307, 304 y 294 kJ/mol para TU, BTU y TT, respectivamente. Los espectros de absorción transitoria obtenidos tras excitación láser (longitud de onda exc = 308 nm) presentaron una banda desde 500 nm a 700 nm, que se asignó a la absorción triplete-­triplete mediante un proceso de transferencia de energía usando bifenilo como aceptor. Los tiempos de vida de triplete fueron de 70 ns, 1.1 microsegundos y 2.3 microsegundos para TU, BTU y TT, respectivamente. A pesar de la similitud estructural de los compuestos, los datos fotofísicos determinados por fosforescencia y fotólisis de destello láser fueron dispares para los tres compuestos, por ello se realizaron cálculos teóricos B3LYP/aug-­ cc­-pVDC/PCM. Los resultados obtenidos concordaron con los experimentales, respaldando la naturaleza pp* de los estados triplete excitados más bajos. En segundo lugar, se analizó la influencia del impedimento estérico en posición C5 sobre la formación de lesiones bipirimidínicas. Para ello se comparó la reactividad del 5-­tert-­butiluracilacetato de metilo (1c) con la de su análogo de timina (2c) tras fotosensibilizar con benzofenona, acetona y xantona. En general 1c reaccionó más lentamente que 2c. La reacción con benzofenona (BP) dio lugar exclusivamente a oxetanos. En el caso de usar acetona como sensibilizador se obtuvieron dímeros mixtos uracilo-­5 tert-butiluracilo (1e-­1 y 1e-­2), el derivado acetonilo (1e-­3) y un fotoproducto fruto de la deshidrogenación (1e-­4). En el caso de la xantona solo se observó la formación de un único oxetano (1f). Sin embargo, las irradiaciones paralelas llevadas a cabo con 2c, condujeron a la formación de dímeros ciclobutánicos en todos los casos. Los resultados obtenidos indican que la presencia de un grupo voluminoso en C5 impide la formación de dímeros ciclobutánicos. A continuación se exploró la fotoquímica de la timina desde su estado excitado triplete superior np* a través de la fotorreacción de Norrish-­¿Yang. La estrategia a seguir consistió en poblar dicho estado por transferencia de energía desde un estado excitado triplete superior de un fotosensibilizador adecuado. Para ello se diseñó una diada formada por el compuesto 5-­tert-­butiluracilo enlazado mediante una amida alifática al cromóforo benzofenona (BP). Se eligió la BP como fotosensibilizador debido a que presenta un Tn con una energía y un tiempo de vida (~ 400 kJ/mol y 37 ps, respectivamente) adecuados para poder participar en el proceso. Así, se llevó a cabo la excitación multifónica de la diada con un haz de láser a una potencia elevada (láser de Nd:YAG, 355 nm, 40 mJ/pulso) y posterior mente la mezcla de reacción se analizó mediante UPLC-­¿MS/MS. Los resultados evidenciaron la formación de la pirimidona esperada tras tener lugar la reacción de Norrish-­¿Yang con un rendimiento químico del 0.003 %, en concordancia con el resto de procesos que ocurren desde estados excitados superiores.Finalmente, la demostración de que el proceso analizado es de naturaleza bifotónica se consiguió tras seguir el rendimiento de la reacción en función de la potencia de láser usada. El último capítulo de la tesis aborda la posibilidad de que el fotoproducto (6,4) una vez formado en el ADN, actúe a su vez como fotosensibilizador endógeno, debido a que esta lesión es capaz de absorber la luz en la región UVB-UVA debido a la presencia en su estructura de 5-­metil-­2-­pirimidona (Pyo). Para ello 206 se sintetizó el desoxiribonucleósido y se irradió en presencia de ADN. El análisis de los daños fotoinducidos en la biomacromolécula al hacerla migrar a través de un gel de agarosa en presencia y ausencia de T4 endonucleasa V, permitió establecer que Pyo es un fotosensibilizador del ADN, y que aproximadamente el 20 % de los daños son dímeros ciclobutánicos. Además, los estudios fotofísicos llevados a cabo con Pyo confirmaron que puede parti-­¿ cipar tanto en procesos de transferencia de energía como en procesos oxidativos puesto que su triplete tiene una energía mayor que la de la timina aislada y en el ADN y además genera radicales hidroxilo y oxígeno singlete. Seguidamente se pasó a considerar el potencial fotosensibilizador del propio daño 6,4 PP, puesto que las propiedades fotoquímicas de la molécula completa podrían diferir del cromóforo aislado. Su irradiación en presencia de ADN reveló que el daño actúa como fotosensibilizador de la misma forma que su cromóforo, a pesar de que sus propiedades fotofísicas no son del todo coincidentes. Así, el último capítulo de la presente tesis ha servido para establecer que el propio daño 6,4 PP puede actuar como caballo de Troya y extender la fracción activa de la radiación UV, provocando la formación de dímeros pirimidínicos y daños oxidativos, convirtiéndolo en un daño potencialmente más peligroso de lo estimado hasta la fecha. Referencias: Modern Molecular Photochemistry of organic molecules; University Science Books: Herndon VA; Turro N. J.; Ramamurthy V.; Scaiano J. C; 2010. Encinas, S.; Belmadoui, N.; Climent, M. J.; Gil, S.; Miranda, M. A.; Chem. Res. Toxicol.; 2004, 17, 857. Cuquerella, M. 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