Contribución al conocimiento de la criptosporidiosis en diferentes regiones de Colombia a partir de aislados procedentes de humanos y diversas especies animales

Resumo

En el presente trabajo se han investigado algunos aspectos de la epidemiología y el control de la criptosporidiosis en diversas regiones de Colombia. En un primer objetivo se estudió la presencia y diversidad genética de Cryptosporidium en muestras de origen humano y animal y se investigó su relación con diversas variables relacionadas con el hospedador como la edad, presencia de diarrea o procedencia geográfica. Para ello se analizaron muestras fecales de origen humano (663 individuos menores de 19 años), ganado vacuno (432 terneros menores de 35 días procedentes de 74 explotaciones) y ganado porcino (233 cerdos de diferentes fases de crianza procedentes de 19 explotaciones). En todas las muestras se investigó la presencia de ooquistes de Cryptosporidium mediante técnicas microscópicas como la tinción negativa de Heine (muestras de terneros) o la tinción de Ziehl-Neelsen modificada previa concentración por sedimentación (muestras de origen humano y porcino), seleccionando las que resultaron positivas para llevar a cabo su estudio molecular. En las muestras positivas se extrajo en primer lugar el ADN del parásito y se procedió a la amplificación por PCR y posterior análisis (restricción enzimática, secuenciación) de diversos marcadores para identificar la especie (gen SSu-rRNA) y subtipo (gen GP60) de Cryptosporidium. Asimismo, se llevó a cabo un análisis de fragmentos multilocus con cinco microsatélites (ML1, ML2, TP14, 5B12, CP47) y cuatro minisatélites (MSB, MSC6-7, cgd2_3850, cgd6_5400). El estudio molecular se hizo extensivo a los aislados de Giardia identificados en las muestras de origen humano, en los que se identificó la especie y ensamblaje mediante amplificación por PCR y posterior secuenciación de los genes ssu-rRNA, β-giardina y triosa fosfato isomerasa. El análisis microscópico permitió identificar ooquistes de Cryptosporidium en muestras de 115 terneros (26,6%) pertenecientes a 44 explotaciones (59,5%). La infección ha sido diagnosticada en terneros de 3 a 35 días de edad, aunque la prevalencia fue significativamente mayor en los de 8 – 14 días (40,7%). Los terneros menores de 21 días tenían hasta 4,3 veces más posibilidades de estar infectados que los mayores de 21 días, lo cual confirma que el riesgo de estar infectado está estrechamente asociado con la edad. Análogamente, la probabilidad de padecer diarrea se incrementó hasta 7 veces en los terneros parasitados en comparación con los no parasitados. La mayoría de aislados de origen bovino caracterizados a nivel molecular (71/73) fueron identificados como C. parvum y asignados a ocho subtipos de la familia IIa, con claro predominio de una variante no descrita previamente en la bibliografía científica (IIaA18G5R1). El estudio multilocus reveló una diversidad genética moderada (22 subtipos multilocus = SML) y una estructura de poblaciones predominantemente panmíctica. La mayoría de SMLs fueron únicos y distintivos de determinadas explotaciones bovinas. La infección por Cryptosporidium fue mucho menos prevalente en ganado porcino, puesto que únicamente se identificaron ooquistes en 15 animales (6,4%) de 7 explotaciones, aunque este hallazgo constituye la primera denuncia de este protozoo en cerdos en Colombia. La infección fue más frecuente en animales en la etapa de precebo (21-63 días) (14,9%) y no estuvo asociada estadísticamente con la presencia de diarrea. El análisis molecular únicamente proporcionó un resultado positivo en dos aislados que fueron identificados como C. parvum. El estudio coprológico en población humana confirmó la infección por Cryptosporidium en 42 personas (6,3%), siendo más frecuente en niños procedentes de colegios (10,7%) que en muestras de origen hospitalario, así como en individuos de procedencia rural (12%) en comparación con los de origen urbano. C. parvum fue la especie identificada en la mayoría aislados correctamente caracterizados (32/34), siendo C. hominis muy poco prevalente. Cabe destacar el alto porcentaje de portadores asintomáticos y la escasa diversidad genética de ambas especies en el locus GP60, ya que todos los aislados fueron asignados al mismo alelo (C. parvum: 351pb; C. hominis: 384 pb). El estudio multilocus fue realizado con base a la combinación del locus GP60 y los dos únicos microsatélites que amplificaron de manera regular en la mayoría de aislados (TP14, MSB) y reveló cinco MLTs, tres en C. parvum y dos en C. hominis. El estudio molecular también se pudo realizar con 20 aislados de Giardia duodenalis de origen humano, que fueron asignados a los ensamblajes/subensamblajes B (n: 11), A (n: 2) y AII (n: 7). En un segundo objetivo del trabajo de investigación se utilizó un modelo experimental de ratones con el fin estudiar la capacidad de diversos péptidos sintéticos de C. parvum para estimular la producción de anticuerpos neutralizantes y valorar su utilidad como candidatos para una vacuna frente a la criptosporidiosis. Para ello se diseñaron in silico y sintetizaron un total de siete péptidos derivados de tres proteínas de C. parvum (P23, CP15 y CSL), que fueron inoculados en diversos grupos de ratones siguiendo un protocolo establecido. La producción de anticuerpos séricos en los ratones inoculados fue analizada mediante una técnica ELISA y su capacidad neutralizante fue investigada mediante amplificación por PCR del extracto de cultivos celulares inoculados con ooquistes incubados con el suero de los diferentes grupos experimentales. Los siete péptidos sintetizados estimularon la producción de anticuerpos en los ratones, especialmente cuando eran inoculados con un inmunoestimulante (FIS) y adyuvante. Las mejores respuestas se observaron en los animales inoculados con cuatro péptidos, dos derivados de la proteína CSL y otros dos derivados de la proteína CP15-1, aunque sólo estos últimos mostraron la capacidad de bloquear la infección de las células por parte de los esporozoítos de C. parvum, por lo que podrían considerarse candidatos para una vacuna frente a la criptosporidiosis. Las lesiones tisulares que se observaron en algunos ratones inoculados fueron consecuencia de la formulación utilizada y no del péptido, por lo que se aconseja utilizar adyuvantes menos nocivos en posteriores investigaciones.