Vitrificación de ovocitos (inmaduros y maduros) y embriones ovinos producidos in vitrocomparación de las técnicas ops y ops modificada (mops)

Resumo

La producción in vitro de embriones en pequeños rumiantes es una excelente fuente de embriones a bajo costo para la investigación básica en biología y fisiología del desarrollo, así como para aplicaciones comerciales en nuevas tecnologías. A pesar de la importancia de la especie ovina, la producción in vitro de embriones no había sido explotada, trabajada e investigada como en el bovino o porcino. En los últimos años se ha incrementado la aplicación de los procedimientos de producción in vitro de embriones a tal punto que en un futuro estos embriones pueden llegar a ser utilizados en programas comerciales de producción de embriones in vitro a gran escala, pero para conseguirlo es indispensable la criopreservación embrionaria tanto por razones económicas como científicas. Sin embargo los trabajos publicados sobre criopreservación de ovocitos y embriones aún son muy escasos. En el presente trabajo se han planteado tres experiencias las cuales se sintetizan a continuación: En la primera experiencia se evaluó la capacidad de los ovocitos de cordera con y sin células del cúmulus para alcanzar la maduración in vitro, a la vez que se evaluó, bajo las mismas condiciones, el efecto de la BSA y el SS como agentes de capacitación de semen congelado, en función de la tasa de división y posterior desarrollo embrionario. Los resultados reflejaron diferencias significativas (p<0.001) en cuanto a la proporción de COCs y ODs que alcanzaron el estadio de MII. (69.5 vs 31.1% respectivamente). Por otro lado, nuestros resultados nos permiten reafirmar la importancia de las células del cúmulus en la MIV del ovocito, ya que reflejan que la presencia o ausencia de estas células afecta significativamente (p<0.001) la tasa de división a 24 hrs post FIV. En cuanto al desarrollo embrionario a blastocistos observamos que tan sólo los resultados de OD fecundados con semen capacitado con BSA son significativamente menores a los esperados (p=0.026). De igual manera hemos podido comprobar que bajo las mismas condiciones de trabajo, tanto la BSA como el SS son buenos agentes de capacitación espermática en la especie ovina y su uso dependerá de la disponibilidad que se tenga de ellos, ya que en el caso de la BSA su uso puede estar prohibido por cuestiones sanitarias. En la segunda experiencia se vitrificaron ovocitos inmaduros, ovocitos madurados in vitro y embriones producidos in vitro. La vitrificación se realizó con las pajuelas convencionales OPS y las que hemos modificado y denominado micro OPS. En esta experiencia se evalúo la tasa de ovocitos que alcanzaron la MII tras 24 hrs. de MIV. Por otro lado, también se evaluó la tasa de división a 48 hrs. post inseminación y el desarrollo embrionario a 168 hrs. post inseminación, así como el efecto del método de vitrificación en la supervivencia de los embriones producidos in vitro. Como prueba complementaria se realizaron ensayos de almacenamiento y recuperación de grandes cantidades de ovocitos vitrificando 3, 10 o 15 ovocitos por pajuela. Independientemente del estadio en el cual se vitrifican los ovocitos, nuestros datos no nos permiten determinar diferencias estadísticas entre los métodos de vitrificación empleados en los dos grupos. En cuanto a los ovocitos clasificados como indefinidos no es posible encontrar diferencias estadísticas entre los métodos de vitrificación, tan sólo podemos apreciar diferencias porcentuales en contra los ovocitos inmaduros (ambos) y maduros (OPS), siendo superiores a lo esperado. Independientemente del método de vitrificación empleado, podemos determinar diferencias significativas (p<0.001) en la proporción de ovocitos en MII cuando son vitrificados inmaduros en comparación con los ovocitos control. También encontramos diferencias estadísticas en los ovocitos determinados como indefinidos tras 24 hrs. de MIV debidas al proceso de vitrificación. De igual forma e independientemente del método de vitrificación empleado se pueden evidenciar diferencias estadísticas (p<0.001), tanto en las tasas de división como en las de desarrollo embrionario, debidas al estadio meiótico al momento de la vitrificación, y al igual que en la evaluación de la MIV este efecto es más drástico conforme más temprano es el estadio meiótico de los ovocitos al momento de la vitrificación. Estas diferencias son más evidentes si se comparan los resultados de los ovocitos vitrificados con los ovocitos control (p<0.001).Para la supervivencia embrionaria in vitro no se pudieron determinar diferencias significativas entre los métodos de vitrificación debido al número tan limitado de embriones vitrificados/desvitrificados, tan sólo podemos apreciar pequeñas diferencias porcentuales a favor de las pajuelas micro OPS en cuanto a la tasa de blastocistos reexpendidos (p<0.745) y blastocistos eclosionados (p<0.516) tras la vitrificación/desvitrificación y cultivo de estos embriones. En base a los resultados de las pruebas de almacenamiento y recuperación de ovocitos podemos determinar diferencias estadísticamente significativas entre el tipo de pajuela empleado cuando vitrificamos 3 ovocitos/pajuela (p=0.014) y cuando vitrificamos 10 o 15 ovocitos/pajuela (p<0.001). Por lo tanto las pajuelas micro OPS se presentan como uno de los métodos capaces de asegurar la recuperación total del material vitrificado. En la tercera experiencia se evaluó la tasa de recuperación y el porcentaje de ovocitos útiles tras la vitrificación de 10 ovocitos por pajuela. Además se comparó el efecto de 24 o 26 hrs. de maduración in vitro en ovocitos vitrificados inmaduros, madurados in vitro y ovocitos sin vitrificar (control), en ellos se evaluó el efecto del tiempo de MIV en función de la presencia de corpúsculos polares. A los distintos grupos de ovocitos se les aplicó el protocolo de PIVE, con la particularidad que la fecundación se realizó mediante ICSI con lo cual, se evaluó la tasa de división a 48 hrs. post inseminación y el desarrollo embrionario a 168 hrs. post inseminación. Una vez más se comprobó la validez de las pajuelas micro OPS para almacenar grandes cantidades de ovocitos, así como la efectividad de estas pajuelas en la recuperación de la totalidad del material vitrificado. En base al porcentaje de ovocitos determinados como útiles quedan establecidas diferencias estadísticas (p<0.001) entre los ovocitos vitrificados inmaduros frente a los ovocitos vitrificados maduros 24 (90.0 y 91.9% vs 99.6 %). En los ovocitos vitrificados inmaduros, vitrificados tras 22 hrs. de maduración in vitro y los ovocitos control que presentaron CP tras completar un periodo de 24 o 26 hrs. de maduración, e independientemente del grupo de ovocitos, no se hallaron diferencias estadísticas por efecto del periodo de MIV. Aunque en los grupos control podemos apreciar diferencias porcentuales a favor de los ovocitos que recibieron el periodo de MIV de 26 hrs. (47.0 y 64.5% para 24 y 26 hrs de MIV respectivamente). En los ovocitos vitrificados inmaduros no se llevó a cabo la ICSI debido al nulo o muy limitado número de ellos que presentaron CP tras 24 o 26 hrs. de MIV (0.0 y 2.7%, respectivamente). Por otro lado y a pesar de no poder determinar diferencias significativas entre los ovocitos vitrificados maduros y los ovocitos control, se aprecia que los porcentajes más altos de ovocitos con CP se obtienen al aplicar un periodo de MIV de 26 hrs. Independientemente del periodo de MIV aplicado, tanto en ovocitos vitrificados tras 22 hrs. de MIV como en los utilizados como control, no fue posible determinar diferencias estadísticas en las tasas de división (p=0.496). En términos de desarrollo embrionario a blastocistos tampoco fue posible determinar diferencias estadísticas (p=0.088), aunque en ambos grupos los mayores porcentajes de blastocistos se obtuvieron en los ovocitos sometidos a un periodo de MIV de 26 hrs. Como conclusión final diremos que las pajuelas micro OPS son una alternativa viable para la vitrificación de ovocitos y embriones pues han demostrado ser tan buenas como las OPS convencionales, pero además presentan la ventaja de que no flotan durante el almacenamiento y asegurar la recuperación total del material vitrificado. Por último, a día de hoy nuestros resultados son los primeros que se reportan en cuanto a la tasa de división y desarrollo embrionario de ovocitos madurados in vitro vitrificados y fecundados mediante ICSI.