Estudio de las tintas de impresión y de la radiación gamma en el envase alimentario y desarrollo de un nuevo material antimicrobiano

Resumo

Introducción El trabajo de investigación llevado a cabo en esta tesis se enmarca en el área de la seguridad alimentaria. Se abarcaron diferentes conceptos, desde las bases del alimento y su deterioro, a los métodos de conservación, el envase alimentario y el envase activo, o la seguridad de los envases para el consumidor. Concretamente, se estudiaron los conceptos de seguridad alimentaria referentes al envase alimentario, centrándose en los procesos de esterilización como la Radiación gamma y en los efectos de fenómenos como el set-off, o transferencia de compuestos de la cara exterior del envase a la cara en contacto con el alimento, que tienen lugar durante su fabricación y almacenamiento. Además, se estudiaron en profundidad conceptos relacionados con el envase activo, con el fin de desarrollar un nuevo material antimicrobiano: microorganismos causantes del deterioro alimentario, selección de sustancias activas naturales, estudio de la combinación entre ellas, sus mecanismos de acción de manera libre y formando parte del envase activo, desarrollo de un nuevo material antimicrobiano, estudio de la estabilidad tanto química como microbiológica a lo largo del tiempo del nuevo envase activo, o el estudio del efecto antimicotoxigénico frente a un moho productor de ocratoxinas. En todas las investigaciones realizadas se revisaron y se cumplieron las legislaciones que regulan cada uno de los apartados mencionados. Memoria Objetivos Los objetivos de la presente tesis han estado orientados al estudio de la seguridad alimentaria, abarcando diferentes aspectos dentro de esta área. Para ello, el desarrollo experimental se llevó a cabo para cumplir los siguientes objetivos generales: • Evaluación de la seguridad de envases alimentarios esterilizados con radiación γ y seguimiento en función del tiempo. • Evaluación de la seguridad de envases alimentarios analizando el fenómeno de migración de tintas de impresión por set-off. • Estudio del mecanismo de acción de diferentes agentes antimicrobianos y evaluación de sus propiedades antibacterianas y antifúngicas • Desarrollo y evaluación de un envase activo antimicrobiano utilizando sustancias naturales. Se desarrollarán para ello métodos analíticos y microbiológicos con el fin de conseguir cubrir la investigación general planteada. En conjunto, se establecieron los siguientes objetivos específicos: • Evaluación de la seguridad de envases alimentarios irradiados con radiación γ, identificando y cuantificando los compuestos generados a través de un método desarrollado de SPME-GC-MS. Influencia del tiempo de almacenamiento del material de envase tras la irradiación. • Evaluación de la seguridad de envases alimentarios estudiando para ello el fenómeno de migración de tintas por set-off, identificando y cuantificando los compuestos migrados en diferentes estructuras del envase a través de un método desarrollado de GC-MS. • Evaluación de las propiedades antibacterianas y antifúngicas de varios aceites esenciales. • Estudio de las interacciones entre ellos, analizando su comportamientos aditivos, indiferentes, antagónicos y sinérgicos. • Desarrollo de un método GC-MS para el estudio del mecanismo de transferencia en fase vapor de los aceites esenciales mediante GC-MS. • Estudio del mecanismo de acción de los agentes antimicrobianos, utilizando para ello métodos microbiológicos como las curvas de letalidad, microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido (SEM) y Microscopía Raman. • Desarrollo y optimización de un envase alimentario incorporando el mejor candidato de los agentes activos naturales estudiados. • Evaluación del efecto antimicrobiano causado por el envase activo a lo largo del tiempo, así como su mecanismo de acción utilizando para ello Raman imaging spectroscopy. • Evaluación química de la estabilidad del envase activo antimicrobiano desarrollado. • Estudio de la capacidad antimicotoxigénica del envase activo desarrollado.. • Desarrollo de un método de extracción óptimo para micotoxinas. • Desarrollo de un método de análisis por UPLC-MS/MS para identificar y cuantificar Ocratoxinas. • Evaluación de la ruta de biosíntesis de Ocratoxinas (A, B y C) en el moho Aspergillus ochraceus y su afectación con el uso del envase antimicotoxigénico. Metodología Durante el trabajo realizado en la presente tesis doctoral se ahondó en el conocimiento de técnicas tanto analíticas como microbiológicas, consiguiendo así poder tener resultados interdisciplinares y aportando como consecuencia una mejor visión de las investigaciones realizadas; además del uso de herramientas quimio métricas como el Análisis de Componente Principales (PCA). De esta manera, se han utilizado una gran diversidad de equipos, optimizando en todos ellos métodos de análisis que se adecuaran a las pruebas realizadas en cada ocasión: • GC-MS(Q) • GC-MS(IT) • UPLC-MS(QqQ) • UPLC-QTOF-MS • Raman spectroscopy • Raman Imaging spectroscopy • Microscopía óptica • Microscopía electrónica de barrido (SEM) Ensayos para el estudio analítico: • Ensayos de migración • Recuperación de Tenax® • Desarrollo de un método para estudiar los mecanismo de transferencia de las sustancias activas • Desarrollo de un método de extracción para ocratoxinas • Desarrollo de un método para medidas biológicas usando Raman Técnicas para el estudio microbiológico: • Determinación de la actividad antimicrobiana: o Método de la dilución en caldo o Difusión de vapor o Difusión en agar • Curvas de letalidad, de manera solitaria y combinada • Estudios de combinación de sustancias activas o Método del tablero de ajedrez o Combinación en difusión de vapor o Combinación en difusión en agar • Recuento de colonias por dilución en placa • Preparación de muestras biológicas para Microscopía Electrónica de Barrido • Desarrollo de nuevas tinciones para mohos usando Microscopía óptica Test triangular de olor Desarrollo de un Nuevo envase antimicrobiano Programas utilizados: • Microsoft Office • MassLynx • MassFragment • OriginPro8 SR0® • OMNIC 9® • Unscrambler ® • Chemstation • Varian Workstation Búsqueda de bibliografía y legislación relacionada con cada uno de los temas de estudio y para discusión de los resultados obtenidos Resultados y discusión A continuación se presenta a modo de resumen final, una exposición de las conclusiones más relevantes obtenidas durante la tesis doctoral. 1. La seguridad de los envases alimentarios puede verse afectada por el fenómeno del set-off, definido como la transferencia de compuestos desde la capa externa del material a la capa que estará en contacto con el alimento durante el almacenamiento del material en rollos. No obstante, el trabajo realizado ha demostrado que este fenómeno, y por tanto la migración de compuestos de capas externas al alimento, puede evitarse en gran parte con un diseño adecuado del material. La aplicación de un barniz en la capa externa o el cambio de ubicación de las tintas a una cara más interna de los materiales multicapa, demostró una gran reducción o incluso desaparición de migrantes procedentes del proceso de set-off. 2. La aplicación de radiación γ a los materiales de envase alimentario modificó el perfil de los compuestos volátiles detectados en fase vapor pero no comprometió su seguridad. Todos los materiales estudiados esterilizados mediante radiación γ fueron completamente seguros para los consumidores, dado que la concentración de los compuestos liberados fue considerablemente menor a los límites que establece la regulación Europea. Además, los materiales irradiados y almacenados durante 8 meses demostraron mantener su integridad física además de una reducción media de alrededor del 45% en la concentración de los compuestos detectados tras realizar la irradiación. 3. Se estudió el uso de los aceites esenciales de canela y mostaza (AITC), y el compuesto activo isotiocianato de bencilo (BITC) como agentes activos para el diseño de nuevos envases con propiedades antimicrobianas que mejoraran la seguridad del alimento envasado. Todos demostraron tener una gran actividad antimicrobiana frente cepas bacterianas y fúngicas causantes de contaminaciones en los alimentos. El aceite esencial de mostaza así como el BITC mostraron una actividad antimicrobiana mucho mayor al aceite esencial de canela; tanto en dilución en caldo, como en difusión en vapor o en agar. Por otro lado, las diez cepas de mohos testadas resultaron ser mucho más sensibles a la actividad de los agentes activos utilizados que las nueve cepas bacterianas. 4. La combinación de agentes activos permitió estudiar la posibilidad de sinergias que mejoraran la capacidad antimicrobiana del envase activo con una menor cantidad de agentes activos incorporados. Se observaron efectos sinérgicos, aditivos o indiferentes entre el aceite esencial de mostaza y el de canela en dilución en caldo tanto en su actividad bactericida como bacteriostática, fungicida y fungistática. En ningún caso se observaron efectos antagónicos. Se observaron efectos aditivos o sinérgicos en difusión de vapor y agar frente a las cepas estudiadas de mohos y bacterias. 5. Debido a la efectividad del aceite esencial de mostaza como agente antimicrobiano in-vitro, se probó su actividad in vivo. Los resultados mostraron su eficacia en el envasado de rebanadas de pan de hogaza, inoculadas y sin inoculadas con R. stolonifer. La presencia del agente activo ejerció un efecto protector, alargando su vida útil tanto si fueron almacenada a 25ºC como a 4ªC. Además, la combinación del aceite esencial de mostaza con el de canela (1:100) permitió el uso de este agente activo sin que las propiedades organolépticas del alimento envasado se viesen dañadas. Este hecho abre la posibilidad de utilizar una mezcla de aceites esenciales con una muy alta actividad antimicrobiana y propiedades organolépticas adecuadas para productos de panadería. 6. Pese a la alta efectividad del aceite esencial de mostaza, su incorporación de manera homogénea al envase activo resultó complicada debido a la alta volatilidad del compuesto principal, el isotiocianato de alilo (AITC). Por esta razón se comenzó a trabajar con un compuesto de naturaleza similar pero con una volatilidad menor, el isotiocianato de bencilo (BITC). Mientras que el mecanismo de transferencia del AITC seguía un modelo de difusión por convección, el BITC, al igual que el aceite esencial de canela, presentó un modelo de difusión desde el centro al exterior. 7. El estudio del mecanismo de acción de las sustancias activas es un paso fundamental para poder optimizar el desarrollo de un envase antimicrobiano, ya que permite conocer cómo actúan los agentes activos a nivel microbiológico. La microscopía electrónica de barrido (SEM) mostró ser una herramienta muy útil para este fin. Los resultados mostraron que el mecanismo de acción de los aceites esenciales de canela, mostaza y el BITC frente a Escherichia coli sucedió de manera intracelular, con la diferencia de que el aceite esencial de mostaza indujo la detención del ciclo celular, el BITC produjo cambios en la forma celular y aparición de septums, mientras que el aceite esencial de canela produjo agregación y protuberancias. Se estudió también la acción del BITC a nivel molecular utilizando para ello espectroscopía Raman. El BITC se acumuló en las células donde causó alteraciones en componentes esenciales como sacáridos, aminoácidos, proteínas, lípidos o enzimas; viéndose afectadas como consecuencia varias funciones celulares como el ciclo celular o la homeostasis intracelular. 8. Con el fin de garantizar la seguridad alimentaria, se desarrolló un nuevo envase antimicrobiano basado en el uso de etiquetas autoadhesivas como soporte de agentes activos para incorporarlos en la parte interna del envase alimentario. Se realizó un screening con varias sustancias activas (aceite esencial de canela, de orégano, de mostaza y el BITC), y el BITC fue seleccionado por su alta actividad. Se evaluó la estabilidad y actividad tanto de manera química como antimicrobiológica del envase antimicrobiano desarrollado con dos materiales diferentes (papel de filtro y polipropileno). Las etiquetas resultaron ser estables por encima de 40 días y activas frente a mohos productores de ocratoxinas; presentando actividad durante todo el tiempo de análisis, 140 días. 9. El material antimicrobiano desarrollado demostró tener una elevada actividad antifúngica, mostrando una reducción en el crecimiento del moho a lo largo del tiempo con tres diferentes zonas de crecimiento: crecimiento, retardo e inhibición; además de provocar la inhibición de la reproducción sexual del moho. 10. Debido a la importancia de conocer como ejerce su efecto el material activo desarrollado, se evaluó su mecanismo de acción en el moho productor de ocratoxinas Aspergillus ochraceus, tanto a nivel molecular como morfológico. • Se evaluó el mecanismo de acción del BITC tanto en contacto directo, como en vapor generado por el envase activo desarrollado en el moho productor de ocratoxinas Aspergillus ochraceus. El BITC se acumuló dentro de las células del moho donde causó alteraciones en componentes esenciales como sacáridos, aminoácidos, proteínas, lípidos o enzimas, alterando de esta manera funciones celulares como son la respiración, el metabolismo o el ciclo celular. De esta manera se confirmó que la técnica espectroscópica "Espectroscopía Raman de Imagen" es una gran herramienta no destructiva y específica para la adquisición de información a nivel morfológico y molecular sobre la composición de muestras biológicas. • Se evaluó su afectación a nivel morfológico utilizando para ello Microscopía Electrónica de Barrido (SEM). El agente activo BITC liberado del material antimicrobiano sobre el moho A. ochraceus fue acumulado en el interior de las células, causando alteraciones morfológicas en mayor o menor grado dependiendo de la zona de crecimiento. En la zona de crecimiento, se observaron diferentes efectos como la inhibición de la reproducción sexual, cambios en la forma de las esporas y aparición de agujeros, y reducción del número de conidióforos y esporulación. En la zona de retardo sólo se observó micelio vegetativo, el cual mostró una agregación entre las hifas además de agregaciones internas. En la zona de inhibición se observaron esporas inviables provenientes del inóculo inicial. 11. El material antimicrobiano desarrollado demostró tener una gran actividad antimicotoxigénica, produciendo una gran disminución en la producción de ocratoxinas por el moho Aspergillus ochraceus, especialmente de la ocratoxina A (OTA), la más tóxicas de ellas. Además de la reducción, modificó la relación en la producción de OTA/OTB, aumentando la proporción de OTB. Para poder evaluar el efecto antimicotoxigénico de la etiqueta activa fue necesario desarrollar un método de extracción y de análisis que se ajustara ampliamente a los límites legales establecidos. Es importante destacar que gracias al uso del UPLC-QTOF-MS, se mostró que el envase activo no sólo actuó como inhibidor de ocratoxinas, sino que también modificó el metabolismo de la producción de otros metabolitos secundarios, como antibióticos. 12. Todos los resultados obtenidos además del hecho de que el envase es económico y fácil de ser incorporado, hace que sea un envase muy atractivo para garantizar la inocuidad de los alimentos. Bibliografía Con los resultados obtenidos se ha llevado a cabo un total de 5 artículos publicados en revistas de alto impacto (cuartil 1) y 2 artículos que están siendo evaluados. Clemente, I., Aznar, M., Nerin, C., & Bosetti, O. (2016). Migration from printing inks in multilayer food packaging materials by GC-MS analysis and pattern recognition with chemometrics. Food Additives and Contaminants Part a-Chemistry Analysis Control Exposure & Risk Assessment, 33(4), 703-714. Doi: 10.1080/19440049.2016.1155757. Salafranca, J., Clemente, I., Isella, F., Nerin, C., & Bosetti, O. (2015). Influence of oxygen and long term storage on the profile of volatile compounds released from polymeric multilayer food contact materials sterilized by gamma irradiation. Analytica Chimica Acta, 878, 118-130. Doi: 10.1016/j.aca.2015.03.055. Clemente, I., Aznar, M., Silva, F., & Nerín, C. (2016). Antimicrobial properties and mode of action of mustard and cinnamon essential oils and their combination against foodborne bacteria. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 36, 26-33. Doi: 10.1016/j.ifset.2016.05.013. Clemente, I., Aznar, M., Salafranca, J., & Nerin, C. (2016). Raman spectroscopy, electronic microscopy and SPME-GC-MS to elucidate the mode of action of a new antimicrobial food packaging material. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 409(4), 1037-1048. Doi: 10.1007/s00216-016-0022-y. Clemente, I., Aznar, M., & Nerín, C. (2016). Raman imaging spectroscopy as a tool to investigate the cell damage on Aspergillus ochraceus caused by an antimicrobial packaging containing Benzyl isothiocyanate. Analytical Chemistry, 88(9), 4772–4779. Doi: 10.1021/acs.analchem.6b00116. Clemente, I., Aznar, M., & Nerín, C. (2017). New antimycotoxigenic food packaging material containing Benzyl isothiocyanate (submitted to Food and Chemical Toxicology). Clemente, I., Aznar, M., Manso, S., & Nerín, C. (2017). Synergistic properties and antifungal activity of mustard and cinnamon essential oil against several food moulds in vitro and on traditional Spanish bread (submitted to International Journal of Microbiology).