Analisis del patrón de metilación en tumor primario y enfermedad diseminada en neuroblastomaimplicaciones en los procesos de progresión tumoral, metástasis y pronóstico de la enfermedad

Abstract

El neuroblastoma es el tumor sólido más frecuente en la infancia, después de los tumores del sistema nervioso central. Representa el 7% del total de tumores pediátricos, elevándose al 40% durante el primer año de vida. La prevalencia en España es de 1 caso por cada 100.000 nacimientos. El neuroblastoma se caracteriza por una serie de peculiaridades biológicas que lo hacen único entre los procesos malignos. Estas pecularidades incluyen la alta incidencia de regresión espontánea en determinados casos (estadíos 4S y lactantes), y en el otro extremo la elevada frecuencia de casos con metastasis. El 40-50% de los casos se presenta con metástasis al diagnóstico, siendo las localizaciones más habituales la médula ósea y hueso, seguidas de las ganglionares, hepáticas y subcutáneas. Su pronóstico es altamente variable, dependiendo entre otros factores, del estadio de la enfermedad, de la edad del paciente al diagnóstico y de factores biológicos tales como la amplificación del oncogen MYCN. Los factores pronóstico más importantes son la biología del tumor al diagnóstico y la edad. Los niños mayores de 18 meses con metástasis tienen una supervivencia no superior al 30% en las mejores series publicadas, en cambio, en los lactantes con estadio 4 la superviviencia es superior al 80% y en el estadio 4S superior al 90%. El grado de diferenciación celular también se ha relacionado con el pronóstico, de forma que los tumores más diferenciados presentan un mejor pronóstico. Los pacientes con neuroblastoma metastático se clasifican en estado 4 o 4S (4 especial) atendiendo a características clínicas como la edad y el tipo de metatasis. Sin embargo, ambos metastatizan en médula ósea, pero seguimos sin saber por qué su pronóstico es tan diferente, con superviviencia superior al 90% para el estadio 4S e inferior al 30% en los estadios 4. A excepción de la ausencia de amplificación de MYCN en pacientes con 4S, seguimos sin conocer cuales son las diferencias biológicas que explican un comportamiento clínico totalmente diferente. En los inicios de la biología molecular hubo un considerable progreso en el entendimiento del neuroblastoma a nivel celular y molecular. Estos avances permitieron la identificación de anomalías genéticas que se han podido relacionar con subtipos tumorales. Las alteraciones génicas mejor caracterizadas son la amplificación de MYCN, la pérdida de heterozigosidad en 1p36 y la ganancia del brazo largo del cromosoma 17. La amplificación de MYCN se da solo en un 25% de los casos de neuroblastoma, y se asocia con estadios avanzados de la enfermedad, progresión tumoral rápida y bajas tasas de supervivencia. Recientemente el grupo de Maris describe la importancia como factor pronóstico de la delección del 11q en neuroblastoma metastático sin amplificación de MYCN. En conjunto, las aberraciones génicas descritas con valor pronóstico se encuentran solo en un 25-50% de los tumores neuroblásticos, y por ello, es necesaria la búsqueda de nuevos marcadores con valor pronóstico de la enfermedad, que permitan una mejor clasificación en grupos de riesgo, para optimizar los protocolos de tratamiento. La existencia de metástasis en la médula ósea a lo largo del tratamiento del tumor es buen indicador pronóstico del comportamiento clínico de la enfermedad y tiene importantes implicaciones terapéuticas. Cuando existe enfermedad microscópica, los métodos convencionales de detección de la misma como la histología y la morfología son insuficientes, ya que tienen una sensibilidad limitada en comparación con la inmunocitología o con la detección molecular de marcadores tumorales mediante RT-PCR. El disialogangliósido GD2, detectado mediante inmunocitología, tirosina hidroxilasa (TH), GD2 sintetasa y los genes de las familias génicas GAGE y MAGE detectados mediante RT-PCR han sido los marcadores más estudiados. Además recientemente se han descrito, por diversos grupos, numerosos nuevos marcadores de EMR como es el caso de GALGT, ELAVL4, dopamina decarboxilasa, o STX entre otros. La TH ha sido uno de los marcadores que ha demostrado mayor utilidad para la detección de EMR y el más ampliamente utilizado en los últimos años. Sin embargo, los resultados publicados hasta ahora no han permitido aclarar cual es la implicación de la EMR en el tratamiento del neuroblastoma. Diferentes grupos (COG, SIOPEN, GPOH) han introducido el estudio de enfermedad mínima residual de forma prospectiva en sus protocolos, pero ninguno toma en consideración los resultados para la terapéutica. Parte de las dificultades vienen de la falta de estandarización de las técnicas empleadas, que impiden la comparación de unos grupos con otros, necesidad de nuevos marcadores específicos, y por último contar con series grandes de pacientes y largo seguimiento. Por otra parte, en los últimos años se ha hecho cada vez más evidente el papel fundamental de los eventos epigenéticos en cáncer. Se ha demostrado que los patrones de metilación del DNA y la estructura de la cromatina están profundamente alterados en neoplasias. El gran incremento en el conocimiento sobre cómo la organización de la cromatina modula la transcripción génica, no ha hecho sino resaltar la importancia de los mecanismos epigenéticos en el inicio y progresión de las neoplasias humanas. Estos cambios epigenéticos, en particular la hipermetilación aberrante de regiones promotoras, que se asocia con una represión génica irregular, pueden afectar a la práctica totalidad de los distintos eventos de la progresión tumoral, confiriendo una ventaja selectiva a las células neoplásicas. Determinados autores sugieren que estos procesos pueden igualar e incluso superar en importancia a los mecanismos mutacionales clásicos que afectan a los genes supresores de tumores. Las células tumorales muestran grandes alteraciones en su patrón de metilación comparado con el de las células normales: la hipometilación normalmente implica secuencias de DNA repetitivo, mientras que la hipermetilación afecta a las islas CpG asociadas a promotores génicos. Los estudios de hipermetilación superan en gran proporción a los de hipometilación en cáncer. Hasta la fecha se han identificado numerosos genes hipermetilados en cáncer, entre los que se encuentran aquellos implicados en ciclo celular, reparación del DNA, resistencia a fármacos, apoptosis, diferenciación, angiogénesis y metástasis. Los estudios de metilación del DNA se han focalizado durante las últimas dos décadas en el análisis de genes aislados. Sin embargo, a medida que fueron identificándose cada vez más genes afectados por este proceso, todos estos datos apuntaban a que en algunos tumores, había grupos de genes que incrementaban de forma significativa su grado de metilación. Este fenómeno se ha definido como fenotipo metilador de islas CpG o CIMP, y a su vez permite diferenciar a un grupo de tumores con una frecuencia de metilación aberrante de 3 a 5 veces superior a lo normal. En general, la metilación simultánea de múltiples genes se asocia con un mal pronóstico en múltiples tumores, incluyendo los de cabeza y cuello, pulmón, próstata, cáncer de esófago y leucemias agudas entre otros. En neuroblastoma, también se han llevado a cabo estudios de hipermetilación en tumores primarios y líneas celulares, asociándose el fenotipo metilador a un mal pronóstico. Los resultados obtenidos muestran que suele existir una proporción variable de metilación aberrante, en distintos genes implicados en todos los procesos mencionados anteriormente. No obstante, hay una ausencia total de estos estudios en enfermedad metastática en neuroblastoma, por lo que se desconoce la importancia de los eventos epigenéticos en los procesos de diseminación tumoral, a pesar de su repercusión en la evolución clínica del paciente. OBJETIVOS 1. Determinar la existencia de hipermetilación específica de enfermedad diseminada en neuroblastoma, y su posible papel sobre aquellos genes que participan en distintos procesos celulares relacionados con la capacidad de diseminación tumoral: adhesión a matriz, transducción de señales, ciclo celular, apoptosis, angiogénesis, reparación del DNA o resistencia a fármacos. 2. Determinar la importancia de la hipermetilación en estos genes con el fin de valorar su repercusión sobre el pronóstico, e identificar los genes implicados en el proceso de metastatización en NB mediante el estudio de los cambios de metilación entre tumor primario y metástasis. 3. Confirmar la existencia de un fenotipo metilador en NB de alto riesgo y su posible relación con la progresión tumoral. 4. Determinar la hipometilación específica del gen MAGE-A1 en tumor primario de neuroblastoma, y su relación con la expresión génica del mismo y el pronóstico de la enfermedad. METODOLOGÍA Extracción de DNA genómico. Extracción de RNA y retrotranscripción a cDNA. PCR cuantitativa a tiempo real. Hibridación por Southern-blot. Búsqueda de mutaciones. Análisis de inestabilidad de microsatélites. Modificación del DNA con bisulfito sódico. PCR específica de metilación (MSP).