Human iPSCs use as preclinical model for drug study in cerebrovascular diseases

Resumo

El ictus es la principal causa de mortalidad y morbilidad en los países desarrollados. Un porcentaje relevante de ictus son debidos a diferentes patologías cerebrovasculares con trasfondo genético. El ictus es una enfermedad bien estudiada y sus mecanismos y procesos subyacentes son conocidos. Sin embargo, otras patologías que pueden ser causa de infartos cerebrales presentan una falta de conocimiento y de aproximaciones terapéuticas significativa. Este es el caso de las enfermedades de pequeño vaso, las cuales son causa del 25-30% de los eventos isquémicos. Una de las enfermedades de pequeño vaso más compleja es la arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL), cuyos pacientes presentan una esperanza de vida de 60-65 años y para la cual no existe ningún tratamiento en la actualidad. Por otro lado, mientras que el estudio de este tipo de enfermedades se está revelando como ineficiente para el desarrollo de tratamientos y fármacos efectivos, con el desarrollo en 2006 de la tecnología de reprogramación celular, una nueva aproximación terapéutica apareció para superar las barreras existentes en los modelos animales. En esta Tesis, por primera vez, se ha desarrollado un modelo in vitro para la enfermedad de CADASIL a partir de células pluripotentes inducidas humanas generadas a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes diagnosticados previamente con una mutación asociada a la enfermedad de CADASIL. La reprogramación de las células mononucleares de sangre periférica se realizó mediante el uso de Virus Sendai no integrativos, portadores de los cuatro factores de Yamanaka. Una vez generada la nueva línea de células pluripotentes inducidas humanas con la mutación asociada a la enfermedad de CADASIL, éstas células se utilizaron para estudiar la acumulación anómala y el comportamiento de los dominios de la proteína NOTCH3, al ser ésta objeto de una de las principales alteraciones metabólicas que ocurren en esta enfermedad. Para ello, las células pluripotentes inducidas humanas se diferenciaron a células de la musculatura lisa vascular (principal línea celular afectada en la enfermedad) y también a células endoteliales vasculares (de las cuales se sospecha, pero no está demostrado, que están también implicadas en esta enfermedad). Para comprobar las posibles alteraciones en alguno de los dominios de NOTCH3, se realizaron análisis por inmunofluorescencia y wetern blot en los dos tipos celulares diferenciados, comparando los resultados con las líneas celulares control adecuadas. Los resultados obtenidos mostraron una acumulación del dominio extracelular de NOTCH3 y la presencia de depósitos de NOTCH3 en las células musculares lisas vasculares derivadas de las células pluripotentes inducidas humanas obtenidas a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con CADASIL. Estos resultados confirman este nuevo modelo in vitro de CADASIL y a la tecnología de repogramación celular como una herramienta válida y prometedora para esta enfermedad, abriendo además la posibilidad de desarrollar y probar nuevos tratamientos directamente en células del propio paciente. De esta forma, y gracias a la tecnología de reprogramación celular, esta Tesis supone la primera vez que se consigue un modelo celular in vitro con células del propio paciente para el estudio de la enfermedad de CADASIL.