Análisis funcional de 2 b-galactosidasas de cicer arietinum (bi- y bv-gal) y de tres de la subfamilia a1 de arabidopsis thaliana (bgal1, bgal3 y bgal5) y sus efectos en la estructura de la pared celular

Resumen

El trabajo trata de determinar la función de dos miembros de la subfamilia de B-galactosidasas de garbanzo (BI y BV-Gal) y de tres de la subfamilia a1 de Arabidopsis thaliana (BGAL1, BGAL3 y BGAL5) estableciendo cómo actuan en la pared celular y las posibles alteraciones que orovocan su ausencia (mutantes nulos) y su sobreexpresión (plantas transgénicas que las sobreproducen). Además, se intentará producirlas en un sistema heterólogo en gran cantidad y forma activa de forma de que se puedan llevar a cabo estudios de especificidad de sustrato. En la primera parte se lleva a cabo un estudio funcional de las proteínas de garbanzo en arabidopsis. La proteína BI-Gal se localiza en la pared celular tras analizar la localización subcelular de la proteína fusionada a eGFP. Después mediante 4 técnicas fundamentales se estudia la composición de pared celular en plántulas enteras y diferentes órganos de plántula y planta adulta que no presentan alteraciones morfológicas al compararlas con el WT. 1- El estudio mediante FTIR de las paredes celulares de plántulas de 3 días se combinó con un estudio de análisis principales que mostró variaciones en los niveles de HG, galactosa, ramnosa y arabinosa en las plantas transgénicas en comparación del WT. 2 y 3-Se extrajeron 3 fracciones polisacarídicas de las paredes celulares con composición diferente, estando enriquecidas en pectinas y hemicelulosas. Los polímeros presentes en cada una de ellas se detectaron por ELISA y EDC utilizando una batería de anticuerpos espefíficos frente a polisacáridos de pared celular. Como se observa en el ELISA, el impacto de la sobreproducción de las proteínas es más visible en el caso de las plantas que sobreproducen BI-Gal, aunque de manera general se observan disminuciones en los niveles de galactano que dependiendo del órgano, se compensa por variaciones en los niveles de otros polisacáridos pécticos y hemicelulósicos. Por otro lado, el EDC permite confirmar estas variaciones y además muestra cambios muy significativos en los niveles de XG y xilanos, sobre todo en el entrenudo basal del tallo floral. 4-La inmunolocalización de los epítopos en secciones transvesales de algunos órganos permite observar reducciones en el galactano especialmente en el parénquima medular y las fibras interfasciculares del entrenudo más basal del tallo floral. Se concluye en este apartado que la sobreproducción de estas B-galactosidasas reduce las cadenas laterales de azúcares neutros y esto provoca a su vez una modificación en la solublización del XG. Las diferencias entre las plantas que sobreproducen la BI- y BV-Gal podría deberse a la presencia de un dominio lectina en la BI-Gal. En el segundo apartado se analiza la variación que produce la aplicación de factores que modulan el crecimiento en los niveles de transcrito de la subfamilia a1, centrándose en las proteínas BGAL1, BGAL3 y BGAL5 que se localizan en la pared celular. Aplicando las mismas técnicas que en el apartado anterior se observa que en el hipocotilo del doble mutante bgal1/bgal3 el incremento de galactano y HG podría contribuir al menor crecimiento en el doble mutante nulo. También el incremento en galactano se localiza en la apidermis de este órgano, pudiendo ser otra de las razones para que se produzca este menor crecimiento, ya que controla la elongación del hipocotilo. Resultados similares se observan en hojas y raíces. Es interesante señalar que en el entrenudo apical, que también muestra diferencias en el crecimiento del doble mutante aparecen aumentos muy significativos en el nivel de XG, lo que pone de manifiesto la importancia de las cadenas laterales de azúcares neutros en la relación entre hemicelulosas y celulosas. Por último, se estudian las alteraciones que produce la sobreexpresión de las proteínas BGAL1, BGAL3 y BGAL5 en arabidopsis. En el entrenudo basal del tallo floral de estas plantas transgénicas se ve una menor representación de galactano en difernetes tipos celulares. En el último apartado, se pone a punto un sistema de producción de B-galactosidasas mediante la expresión transitoria de las ORFs que las codifican en hojas de Nicotiana benthamiana. Este sistema permite la obtención de grandes cantidades de proteína que fueron activas frente al sustrato artificial pnp-B-D-galactopiranosido.