Caracterización del papel del sistema nkb/nk3r en el control de la función reproductora

Resumen

Introducción En mamíferos, la adquisición de la capacidad reproductora durante la pubertad y su mantenimiento en la edad adulta son el resultado de un proceso madurativo continuo que se inicia durante la etapa prenatal, con la diferenciación sexual, y continua a lo largo del desarrollo postnatal 1,2. El éxito de este proceso madurativo depende, en gran medida, de la adecuada formación y función del denominado eje Hipotálamo-Hipófiso-Gonadal (HHG), responsable de la integración coordinada de una gran variedad de señales internas y externas, que informan del estado energético del organismo y del medio que le rodea, permitiendo de este modo su modulación 3,4. A pesar de la complejidad organizativa y funcional del eje HHG, el conocimiento de las señales que lo regulan ha crecido considerablemente en las últimas décadas. Entre estas señales, destaca especialmente el sistema hipotalámico ligando-receptor Kiss1/GPR54, constituido por una familia de péptidos estructuralmente relacionados, denominados kisspeptinas (codificados por el gen Kiss1) y su receptor GPR54 2. Actualmente sabemos que las kisspeptinas, además de considerarse los más potentes estimuladores del eje HHG, tienen un papel clave en aspectos esenciales de la reproducción, tales como la diferenciación sexual, la maduración puberal o la regulación de la secreción de GnRH/gonadotropinas 5. Además, estudios neuroanatómicos llevados a cabo en diferentes especies han demostrado que las neuronas hipotalámicas responsables de la síntesis de kisspeptinas se localizan fundamentalmente en dos regiones del hipotálamo: el área preóptica y el núcleo arcuato (ARC). En roedores, estas poblaciones neuronales son funcionalmente diferentes. Mientras que las neuronas kiss1 del área preóptica responden a los estrógenos con un incremento en la síntesis de kisspeptinas, las neuronas kiss1 del ARC responden a estos esteroides sexuales con una inhibición de su síntesis. Estas observaciones sugieren que las neuronas kisspeptina del área preóptica podrían estar implicadas en la generación del pico preovulatorio de gonadotropinas, mientras que las del núcleo ARC podrían mediar el feedback negativo de los estrógenos sobre la secreción de gonadotropinas 6. Curiosamente, estudios recientes han demostrado que las neuronas Kiss1 del ARC, además de producir kisspeptinas, sintetizan otros neuropéptidos: Neuroquinina B (NKB; codificado por el gen Tac2 en roedores) y Dinorfina A (Dyn) 7-10. Por este motivo, esta población de neuronas se han denominado neuronas KNDy (acrónimo que representa las iniciales de los tres neuropéptidos que sintetizan estas neuronas: Kisspetina, NKB y Dyn) 5. Además, evidencias recientes sugieren que estos neuropéptidos juegan un papel importante en el control de la secreción pulsátil de GnRH, a través de la modulación de la secreción de kisspeptinas. En concreto, se ha propuesto que la secreción dinámica de kisspeptinas, que actuarían como efectores finales en la activación de las neuronas GnRH, estaría regulada de forma recíproca por las acciones estimuladoras de NKB y las acciones inhibidoras de Dyn 7-10. La presencia de receptores para NKB y Dyn (NK3R y Oprk1, respectivamente) en las neuronas KNDy avala este modelo de regulación 11. La relevancia fisiológica de NKB en este sistema se ha visto reforzada por la identificación de mutaciones inactivantes en los genes TAC3 y TACR3 (homólogos de los genes Tac2 y Tacr3 en roedores) en pacientes con hipogonadismo hipogonadotropo 12,13; un fenotipo que sugiere el importante papel NKB en el control del eje HHG. A pesar de la importancia de este hallazgo, las acciones reguladoras de NKB y su receptor, NK3R, en el control de la función reproductora aún no han sido caracterizadas en profundidad. En este contexto, el objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido explorar el papel fisiológico del sistema NKB/NK3R en la puesta en marcha de la función reproductora y su posterior mantenimiento durante la edad adulta, haciendo especial hincapié en (i) su modulación por el estado metabólico, (ii) su papel en el control de la secreción de gonadotropinas, así como su interacción con otros neuropéptidos en dicho contexto, y (ii) su sensibilidad al ambiente esteroideo, incluyendo a compuestos estrogénicos con actividad disruptora endocrina, como el BPA. Contenido de la investigación En un primer bloque de experimentos, decidimos explorar la posible contribución de la señalización de NKB a la llegada de la pubertad y su sensibilidad a alteraciones metabólicas en dicho contexto. Para ello, inicialmente analizamos los perfiles de expresión hipotalámica de los ARNm de Tac2 y Tacr3 en muestras hipotalámicas de ratas hembra en diferentes etapas del desarrollo postnatal y su distribución neuroanatómica durante la transición puberal. Nuestros estudios demuestran que la expresión de ambos genes incrementa a lo largo de la maduración postnatal. Además, también observamos que en pubertad tanto Tac2 como Tacr3 se encuentran ampliamente distribuidos en el cerebro, siendo especialmente abundantes en los núcleos LHA (área hipotalámica lateral) y ARC, y que durante la transición puberal incrementa la expresión de Tacr3. Posteriormente llevamos a cabo una serie de estudios funcionales para caracterizar el posible papel de NKB/NK3R en el control central de la pubertad. Nuestros estudios demuestran que la administración central de senktide, un agonista del NK3R, induce la secreción de LH en ratas hembra prepuberales y peripuberales, mientras que la infusión crónica de un antagonista de NK3R durante la transición puberal retrasa moderadamente la llegada de la pubertad y tiende a disminuir los niveles de LH en estos animales. Finalmente decidimos explorar la influencia del estado metabólico del organismo sobre el sistema NKB/NK3R y su impacto sobre la llegada de la pubertad. Nuestros análisis de expresión en ratas hembras puberales sometidas a ayuno durante un periodo de 48h muestran una reducción en los niveles de ARNm de Tacr3 y, en menor medida, de Tac2, sugiriendo que este sistema es sensible a cambios en el estado metabólico durante el periodo puberal. Sin embargo, las respuestas agudas de LH a la administración de senktide en hembras puberales no sólo se encuentran preservadas sino que incluso aumentan en estas condiciones de ayuno; un fenómeno que podría sugerir una cierta sensibilización de la ruta de señalización NKB/NK3R/GnRH a esta condición de estrés metabólico. En la línea de lo descrito anteriormente, nuestros estudios de administración central repetida de senktide en ratas hembra con pubertad retrasada inducida por un protocolo de subnutrición crónica del 30%, demostraron que el restablecimiento de los niveles de NKB mediante esta manipulación es capaz de rescatar la llegada de las pubertad (un 50% de los animales mostraron apertura vaginal, considerado un índice externo de llegada de la pubertad) e incrementar la secreción de LH. En el segundo bloque de experimentos, decidimos explorar el papel de sistema NKB/NK3R en la regulación de la secreción de gonadotropinas y su interacción con otros neuropéptidos en dicho contexto. Nuestros estudios revelan que las respuestas de LH a la administración de senktide presentan un claro dimorfismo sexual en ratas, con una estimulación persistente e independiente del estado del desarrollo en el caso de las hembras y una ausencia de respuesta, a partir del periodo puberal, en el caso de los machos. En términos de secreción de FSH, nuestros estudios documentan la capacidad de NKB de inducir claras respuestas estimuladoras en ratas infantiles/juveniles. Sin embargo, estas respuestas desaparecen en los periodos puberal y adulto; un fenómeno que contrasta con el dimorfismo sexual encontrado en la edad adulta en términos de respuesta secretora de LH a la estimulación de NKB. Posteriormente decidimos explorar el posible papel cooperativo de otros miembros de la familia de las taquiquininas (TKs), tales como la sustancia P (SP) y su receptor NK1R, y la Neuroquinina A (NKA) y su receptor NK2R, en el control de la secreción de GnRH/gonadotropinas. Nuestros datos muestran que durante el periodo prepuberal, al igual que sucede con senktide, la activación de los receptores de SP y NKA induce respuestas estimuladoras significativas de la secreción de gonadotropinas. Sin embargo, en los animales adultos la respuesta a NKA es más modesta. Finalmente, nos propusimos estudiar la posible interacción de NKB con otro de los componentes clave sintetizados en las neuronas KNDy, la Dyn. Para ello, evaluamos inicialmente las respuestas de LH y FSH a la estimulación central con senktide tras el bloqueo de las acciones endógenas de Dyn con nor-BNI, un antagonista de su receptor canónico (receptor-κ-opioide de Dyn; KOR). Nuestros resultados demuestran que el bloqueo de la señalización de Dyn en ratas hembra adultas, no logra alterar ni los niveles de LH basales ni la respuesta de LH a senktide. Por el contrario, el pretratamiento con el antagonista de Dyn en ratas macho, las cuales, como hemos descrito anteriormente, no responden a senktide, no solo aumenta los niveles basales de LH y FSH sino que incluso induce respuestas estimuladoras tras la administración de senktide. En la misma línea, en ratas hembra el pretratamiento con nor-BNI fue capaz de inducir respuestas estimuladoras de la secreción de FSH tras la administración de senktide. Con el objetivo de identificar el mecanismo que subyace a los efectos en el tratamiento con nor-BNI sobre la secreción de gonadotropinas en respuesta a senktide, decidimos analizar la expresión de los genes que codifican Dyn (Pdyn) y KOR (Opkr1) en el hipotálamo mediobasal (MBH) y el área preóptica (POA) de ratas macho y hembra infantiles, prepuberales y puberales. Nuestros estudios documentan una mayor expresión de Pdyn y Opkr1 en el MBH de machos que en el de hembras, reforzando de esta forma la posible relevancia de la señalización central Dyn/KOR en la llegada de la pubertad (retrasada en los machos en relación a las hembras). En el tercer bloque de experimentos decidimos estudiar la sensibilidad del sistema NKB/NK3R al ambiente esteroideo y su posible influencia en el dimorfismo sexual observado en términos de secreción de gonadotropinas. Además, también nos propusimos analizar el impacto específico de un disruptor endocrino con actividad estrogénica, el bisfenol A (BPA), sobre dicho sistema en el contexto específico de la pubertad. Para abordar la cuestión del impacto del ambiente esteroideo en el dimorfismo sexual, analizamos inicialmente la respuesta gonadotrópica a senktide tras la administración de testosterona en ratas hembra adultas, o la inyección de estradiol o dihidrotestosterona (un andrógeno no aromatizable) en ratas macho adultas. Nuestros resultados demuestran que ni la administración de testosterona evita la respuestas de LH a senktide en hembras adultas ni la administración de estradiol o dihidrotestosterona es capaz de restaurar la respuesta de LH a senktide en machos adultos. Sin embargo, la eliminación de los esteroides sexuales mediante gonadectomía en ratas macho y hembra cambia el efecto de senktide sobre la secreción de gonadotropinas, pasando de estimulador a inhibidor. Curiosamente, nuestros estudios también demuestran que el número de neuronas que sintetizan NKB en el núcleo ARC es mayor en ratas hembra adultas que en ratas macho; un fenómeno que podría deberse a las diferencias en el ambiente esteroideo en periodos tempranos de la diferenciación cerebral. En este sentido, nuestros experimentos muestran que la administración de altas dosis de estrógenos (estrogenización neonatal) disminuye tanto el número de neuronas NKB en el ARC en etapas posteriores del desarrollo como la secreción de LH, siendo esta última revertida tras la administración de senktide. Además, nuestros estudios también demuestran que la habilidad de los estrógenos para inhibir la expresión hipotalámica de Tac2 podría ser específica de determinadas regiones hipotalámicas, ya que la administración de estrógenos reduce los niveles de Tac2 en el ARC, pero los incrementa en el LHA. Finalmente, conviene destacar que las observaciones del modelo de estrogenización neonatal descritas anteriormente se vieron reforzadas por estudios adicionales en los que evaluamos el impacto de la exposición perinatal a diferentes dosis de BPA sobre la expresión del ARNm de Tac2 en el núcleo ARC de ratones hembra infantiles (15 días) y puberales (30 días). En concreto, nuestros resultados demuestran que todas las dosis de BPA testadas evitan el incremento en los niveles de ARNm de Tac2 observado en el núcleo ARC durante la transición puberal. Además, este efecto inhibidor es detectado incluso con la dosis más baja de BPA, en las etapas infantil y puberal del desarrollo postnatal; un fenómeno que sugiere la elevada sensibilidad del sistema NKB/NK3R a los efectos organizativos de los compuestos con actividad estrogénica. En línea con estos resultados, los ratones hembra infantiles y puberales expuestos a diferentes dosis de BPA durante el periodo perinatal también presentan un descenso en los niveles de LH, similar al detectado en los animales estrogenizados neonatalmente. Conclusiones Las principales conclusiones de esta Tesis Doctoral son las siguientes: 1. El sistema hipotalámico NKB/NK3R tiene un prominente papel estimulador en el control puberal en la rata hembra, como lo demuestra su incrementada expresión hipotalámica durante el periodo prepuberal, el aumento en la respuesta secretora de LH a la estimulación de NKB durante el periodo prepuberal/puberal y el impacto negativo del bloqueo central de la señalización NKB/NK3R sobre la llegada de la pubertad. 2. El sistema hipotalámico NKB/NK3R está sujeto a regulación metabólica durante la transición puberal en la rata hembra. Mientras su expresión disminuye en el núcleo ARC en condiciones de ayuno, su estimulación farmacológica a nivel central rescata la llegada de la pubertad en condiciones de restricción calórica crónica. 3. Las respuestas secretoras de LH y FSH a la estimulación con NKB varían en función del sexo y el estado del desarrollo. En la rata hembra, la respuesta secretora de LH aumenta independientemente del estado de maduración postnatal, mientras que en la rata macho adulta no se detecta dicho efecto estimulador. En cambio, la respuesta secretora de FSH a la estimulación central de NKB únicamente aumenta en ambos sexos antes de la pubertad, no detectándose ninguna respuesta en la edad adulta. 4. Los sistemas TKs SP/NK1R y NKA/NK2R estimulan la secreción de gonadotropinas en ratas prepuberales, mientras que los animales adultos únicamente presentan respuestas moderadas a la activación de NKA/NK2R. El bloqueo de la señalización de Dyn, en cambio, no altera ni los niveles de LH basales ni la respuesta de LH a la estimulación central de NKB en ratas hembra adultas, mientras que en ratas macho sí que induce respuestas estimuladoras tras la administración de senktide; un fenómeno que sugiere la existencia de un mayor tono inhibidor de Dyn en este sexo. Este comportamiento sexualmente dimórfico se encuentra en consonancia con los datos de expresión de hipotalámica de los genes Pdyn and Opkr1, codificantes de Dyn y su receptor (KOR), cuyos niveles son más abundantes en el MBH de ratas macho en el periodo prepuberal. 5. La expresión hipotalámica del ARNm de Tac2 se encuentra regulada por los niveles estradiol en la rata hembra, presentando un claro dimorfismo núcleo-específico, con un consistente efecto inhibidor en el ARC y un inequívoco efecto estimulador en el LHA. Además, el sistema hipotalámico NKB/NK3R es altamente sensible durante ventanas críticas del desarrollo a los efectos organizativos o disruptivos de los esteroides sexuales o xenoestrógenos (BPA), respectivamente, en roedores. La exposición neonatal a elevadas dosis de estrógenos o xenoestrógenos disminuye la expresión de Tac2 en neuronas NKB del núcleo ARC de ratas de ambos sexos y ratones hembra, respectivamente; un fenómeno que se asocia a una disminución significativa en los niveles de LH circulantes. Por el contrario, el rescate de la señalización de NKB/NK3R en ratas estrogenizadas neonatalmante recupera la respuesta secretora de LH de estos animales.