Caracterización del antígeno reconocido por el anticuerpo monoclonal M22.8 y su posible implicación en la biomineralización de bivalvos

Resumo

En este trabajo se ha intentado profundizar en el conocimiento del antígeno reconocido por el anticuerpo monoclonal (AcM) M22.8 que fue inicialmente desarrollado en el laboratorio de Inmunología de la Universidad de Vigo, para identificar larvas de mejillón Mytilus galloprovincialis. Se ha demostrado que el AcM M22.8 reconoce no sólo larvas, sino también individuos adultos, y se ha localizado el antígeno diana a nivel tisular en el epitelio del borde del manto, así como en líquido extrapaleal, hemocitos de la cavidad extrapaleal y concha. Junto al mejillón M. galloprovincialis, se han analizado otras especies de bivalvos. Fruto de los resultados obtenidos, se propone un modelo de mineralización de la concha en la que los hemocitos y líquido extrapaleal podrían tener un papel muy relevante. Se ha realizado una caracterización exhaustiva del antígeno, se ha sometido a procesos de purificación y concentración, para finalmente estudiar su secuencia proteica mediante espectrometría de masas. En este trabajo se han empleado diversas técnicas que incluyen la electroforesis en una (1D) y dos (2D) dimensiones, Western blot, Dot blot, separación proteica mediante empleo de columnas de inmunoafinidad y columnas de exclusión molecular, inmunohistoquímica, citometría de flujo, y espectrometría de masas, entre otras, que han permitido alcanzar los objetivos inicialmente planteados. El trabajo se ha estructurado en dos capítulos: CAPÍTULO 1. Aborda el uso del AcM M22.8 en individuos adultos de mejillón M. galloprovincialis, con el fin de verificar si el anticuerpo es capaz de reconocer a su antígeno diana, así como identificar su tejido productor. Se ha podido constatar que el anticuerpo M22.8 reconoce a su antígeno -la proteína MSP22.8- en tejido adulto de mejillón de la especie M. galloprovincialis, siendo particularmente relevante el lugar de su localización -el epitelio del lóbulo externo del borde del manto hasta la línea paleal- por su relación con la formación de la concha. Ninguno de los otros tejidos analizados (gónada, branquias, pie, palpo labial, manto central, músculo retractor del biso, glándula digestiva y tracto digestivo), expresaron la proteína MSP22.8. Se ha iniciado una compleja caracterización de la MSP22.8 mediante la realización de diversos estudios de electroforesis en 1D y 2D en muestras de distinta naturaleza. Se ha obtenido información valiosa acerca del comportamiento electroforético mostrado por esta proteína al someterla a diferentes condiciones. Se ha demostrado que la MSP22.8 es secretada hacia la cavidad extrapaleal, pasando a formar parte del componente proteico presente en el fluido que rellena dicha cavidad, no siendo detectada en hemolinfa. Los hemocitos presentes en el fluido extrapaleal contienen en su interior el antígeno MSP22.8. A su vez y de gran importancia, se ha verificado la capacidad que poseen los hemocitos de la hemolinfa para internalizar la proteína, tras ser expuestos a una solución acelular de líquido extrapaleal. Se ha podido demostrar la presencia del antígeno en la concha del bivalvo, formando parte de la matriz orgánica que contiene el exosqueleto de la concha. Los datos obtenidos de la identificación de la MSP22.8 en M. galloprovincialis y su detección en otras larvas (M. edulis, M. chilensis), líquido extrapaleal (M. edulis, X. securis) y concha (M. chilensis, P. canaliculus) permiten deducir que el antígeno se encuentra presente en distintas especies de mejillón procedentes de diferentes latitudes, sugiriendo un alto grado de conservación del epítopo antigénico, y por tanto incrementando el potencial del uso del anticuerpo AcM 22.8 en distintas especies de la familia Mytilidae. CAPÍTULO 2. El capítulo 2 se centra en el estudio de la MSP22.8, en particular en la estrategia seguida para el aislamiento de esta proteína en muestras de líquido extrapaleal e identificación posterior mediante espectrometría de masas. A su vez, se realizan pruebas con objeto de profundizar en el conocimiento del antígeno y se revisa su posible relación con otras proteínas ya caracterizadas y presentes en otras estructuras mineralizadas, abordaje que permite sugerir las posibles funciones en las que pudiera estar implicada la MSP22.8. Se ha completado una compleja caracterización del líquido extrapaleal mediante diversos estudios de electroforesis en 1D y 2D. Se ha obtenido información relativa al perfil electroforético que presenta la MSP22.8, confirmándose como un perfil muy complejo que sugiere la existencia de formas monoméricas, diméricas e incluso multiméricas de la proteína, tanto en el líquido extrapaleal, como en el tejido del borde del manto. Se han llevado a cabo procedimientos para eliminar agentes que interfieran, concentrar el antígeno diana y finalmente purificar la proteína MSP22.8. Para ello se ha utilizado el método de precipitación salina con sulfato de amonio (SA), así como captura del antígeno empleando el AcM unido a bolitas magnéticas o a columnas de inmunoafinidad, así como separación cromatográfica mediante columnas de exclusión molecular. Todos estos procesos tenían como objetivo final la purificación del antígeno, para posibilitar la realización de estudios de espectrometría de masas que permitiesen la identificación de la proteína de interés. Los estudios de proteómica realizados mediante espectrometría de masas frente a bases de datos de proteínas de Mytilus han permitido identificar a la MSP22.8 como una proteína similar al inhibidor de proteasas B1 (PILP-B1), serpina descrita previamente en la concha de mejillón de la especie M. coruscus y que presenta homología con la serpina B9 descrita en ostras de la especie Crassostrea gigas. Las serpinas se caracterizan por poseer un alto grado de conservación en su estructura central, a pesar de la poca homología existente en las secuencias de los distintos miembros de la familia (Huntington 2011). Los datos obtenidos durante la caracterización de la MSP22.8 coinciden con el perfil electroforético mostrado por las serpinas, proteínas caracterizadas por presentar polimorfismo conformacional, existiendo en formas nativas, latentes, delta y polimórficas (Janciauskiene 2001). Con el fin de incrementar la robustez de los resultados, se realizaron búsquedas adicionales frente a secuencias de transcriptomas de manto de las especies M. galloprovincialis y M. edulis, pudiendo observarse que los motores de búsqueda empleados insistían en asignar como candidatas a unas secuencias existentes en ambos transcriptomas que presentaron una gran similitud con la proteína descrita en M. coruscus, sugiriendo un alto grado de conservación de esta proteína entre especies. Los resultados obtenidos y mostrados en ambos capítulos se discuten al final del trabajo. En discusión se sugieren posibilidades de uso del AcM M22.8, así como la posible participación de la MSP22.8, en un modelo de formación de la concha en moluscos bivalvos.