Aplicaciones forenses de las nuevas tecnologías genómicas

Zusammenfassung

En esta tesis se incluyen una serie de trabajos que expanden las herramientas disponibles para los análisis de genética forense. En primer lugar, se exploran las características y ventajas de las plataformas de secuenciación masiva en paralelo (MPS) mediante la validación de paneles comerciales de SNPs de identificación para Ion PGMTM. La principal ventaja de estas tecnologías es su alta capacidad multiplex, que permite analizar hasta cientos de SNPs simultáneamente. Las validaciones incluyeron análisis de muestras comprometidas como ADN degradado, low level y mezclas de ADN; constatando que se pueden expandir los límites de sensibilidad de la plataforma y detectar mezclas de ADN mediante el análisis de SNPs bialélicos. No obstante, para su total implantación en la rutina forense se deben mejorar los software de genotipado y alineamiento. Además, los análisis de calidad de las secuencias (que incluyen coverage, sesgo de lectura de las cadenas, tasa de incorporaciones erróneas, frecuencia de lecturas de los alelos…) indican que existe una baja proporción de SNPs atípicos con un alto riesgo de ser genotipados erróneamente y que, como característica común, presentan secuencias contexto con tractos homopoliméricos y regiones repetitivas. En segundo lugar, se adapta el panel teórico de predicción de ancestralidad biogeográfica EUROFORGEN AIM SNP a dos métodos de genotipado diferentes: electroforesis capilar mediante SNaPshot y la plataforma de MPS Ion PGM. De esta manera, la comunidad forense puede beneficiarse de las principales ventajas del panel: la capacidad para diferenciar las 5 poblaciones definidas continentalmente y la inferencia de proporciones de coancestralidad insesgadas en individuos admixed. La adaptación del panel a SNaPshot permite su implementación en todos los laboratorios de rutina forense, ya que la metodología de análisis precisa de los mismos instrumentos que el análisis de STRs: un termociclador y un equipo de electroforesis capilar. No obstante, debido a las limitaciones de multiplexing inherentes a SNaPshot, se requiere disminuir el número de marcadores del panel original. En el nuevo panel, G AIMs Nano, se incluyen 31 SNPs que representan la mayoría de los marcadores más informativos del panel EUROFORGEN AIM SNP. La adaptación del panel a MPS constituye uno de los primeros trabajos de adaptación de paneles para uso forense personalizados mediante primers AmpliSeqTM para Ion PGMTM. A pesar de que las capacidades multiplex de la plataforma son superiores al número de marcadores incluidos en el panel, durante el diseño de la PCR de captura 3 SNPs de los 128 del panel original tuvieron que ser sustituidos, ya que se sitúan en regiones repetitivas que conllevan problemas de unión inespecífica de los primers. A pesar de la alta tasa de conversión del panel, este hecho apunta a la necesidad de seleccionar conjuntos de posibles marcadores sustitutos durante el diseño de paneles para MPS. Por último, se presentan dos ensayos totalmente optimizados que favorecen el análisis de mezclas de ADN. El primer ensayo reúne 9 nuevos STRs pentaméricos con bajas tasas de stutter, lo que permite descontar más fácilmente estos artefactos de PCR en perfiles complejos. El segundo ensayo reúne un total de 29 SNPs multialélicos analizados mediante SNaPshot que permiten detectar la presencia de una mezcla de ADN de una manera sencilla cuando uno de los marcadores presenta más de dos alelos. Además, los SNPs multialélicos presentan características beneficiosas para los análisis de identificación como una mayor informatividad por marcador. Los nuevos marcadores presentados en estos dos ensayos pueden ser adaptados a las nuevas tecnologías de MPS, manteniendo sus ventajas en el análisis de mezclas de ADN.