Towards the improvement of start-up and operation of Anammox reactors

Resumen

Objetivos y resumen La presente tesis doctoral se enmarca en la depuración biológica de aguas residuales y específicamente en la eliminación de compuestos nitrogenados. Hay tres principales problemas ambientales que pueden ser producidos por la presencia de contaminantes nitrogenados en los sistemas acuáticos: pueden disminuir el pH de los ecosistemas de agua dulce cuya alcalinidad sea relativamente baja, llevando a la acidificación de esas masas de agua; pueden estimular o incrementar el desarrollo y proliferación de los organismos fotosintéticos, resultando en la eutrofización de los sistemas acuáticos; y pueden también causar toxicidad a la vida acuática, con un incremento de la mortalidad y problemas reproductivos. Además, la contaminación por compuestos de nitrógeno de las aguas subterráneas y superficiales puede provocar efectos adversos en la salud humana, como toxicidad aguda, carcinogénesis, mutagénesis y alergias. El nitrógeno se suele encontrar en las aguas residuales mayoritariamente en forma de amonio. Los procesos biológicos convencionales usados para su eliminación en las plantas de tratamiento de aguas residuales se basan en los procesos de nitrificación y desnitrificación. En la nitrificación el amonio se oxida primero a nitrito y después a nitrato, por medio de las bacterias oxidantes de amonio y las bacterias oxidantes de nitrito, respectivamente. El consumo total de oxígeno necesario para convertir el amonio a nitrato es alrededor de 4,2-4,5 g O2/(g N-NH4+). Además, la nitrificación causa un consumo de alcalinidad de aproximadamente 7,1 g CaCO3/(g N-NH4+). Esta alcalinidad puede estar ya presente en el agua residual a tratar o añadirse químicamente. A continuación, el nitrato y/o nitrito formados se reducen a nitrógeno gaseoso por medio de bacterias desnitrificantes que usan materia orgánica como donador de electrones. Sin embargo existen aguas residuales cuya cantidad de materia orgánica biodegradable no es suficiente para llevar a cabo la desnitrificación. En este caso es necesario añadir una fuente externa de carbono que permita completar la desnitrificación, lo que tiene asociado un coste económico. Algunas fuentes externas de carbono típicas son alcoholes de cadena corta (como metanol y etanol), acetato y glucosa. Habitualmente el metanol es la fuente de carbono más barata disponible, por lo que es el compuesto más utilizado. La cantidad de materia orgánica que se necesita por unidad de masa de nitrógeno eliminado es de alrededor de 3,7 g DQO/(g N) cuando se emplea metanol como fuente externa de carbono. Una alternativa relativamente reciente para la eliminación de nitrógeno en aguas con una baja relación DQO/N son las tecnologías basadas en la oxidación anaerobia de amonio (Anammox). Este proceso lo realizan bacterias autótrofas que combinan amonio y nitrito en condiciones anóxicas para dar lugar a nitrógeno gaseoso y una pequeña cantidad de nitrato. Dado que habitualmente el nitrito no está presente en las aguas residuales, es necesario oxidar en torno al 50% del amonio a nitrito (nitrificación parcial). La nitrificación parcial y el proceso Anammox pueden llevarse a cabo en dos unidades independientes. En este caso el primer reactor se opera en condiciones aerobias para convertir aproximadamente la mitad del amonio presente en el influente en nitrito. En el segundo reactor se lleva a cabo la desnitrificación autotrófica (Anammox) en condiciones anóxicas. La nitrificación parcial y el proceso Anammox pueden también realizarse conjuntamente en una sola unidad. Esta tecnología ha recibido diversos nombres como CANON (Completely Autotrophic Nitrogen removal Over Nitrite; eliminación de nitrógeno completamente autotrófica por la vía del nitrito); OLAND (Oxygen-Limited Autotrophic Nitrification-Denitrification; nitrificación-desnitrificación autotrófica en condiciones de limitación de oxígeno) y deamonificación. La principal diferencia entre todas estas tecnologías es que el proceso CANON emplea biomasa en suspensión desarrollándose conjuntamente las diversas especies bacterianas en un medio de reacción bien mezclado, mientras que los procesos OLAND y de deamonificación emplean biomasa en forma de biopelícula, que crece sobre biodiscos o sobre soportes de plástico, como los anillos Kaldnes. La concentración de oxígeno disuelto es la principal variable de operación que debe controlarse a fin de conseguir una operación estable del sistema. Las limitaciones difusionales permiten que el oxígeno sea consumido completamente en la zona externa del gránulo o de la biopelícula, con lo que la zona interna se mantiene anóxica. Por lo tanto, la nitrificación parcial ocurre en la parte externa mientras que las bacterias Anammox crecerán en las capas más internas. En cualquier caso e independientemente de la configuración de los reactores, tanto la nitrificación como el proceso Anammox son autótrofos por lo que no se necesita la presencia de materia orgánica biodegradable para llevar a cabo la eliminación de nitrógeno. Además las necesidades de oxígeno son alrededor del 40% inferiores cuando se comparan con las de la nitrificación/desnitrificación convencional porque sólo se necesita oxidar el 50% del amonio a nitrito. La producción de lodo también es muy inferior debido a la reducida productividad de biomasa de los organismos autótrofos. Por lo tanto, el proceso de nitrificación parcial/Anammox puede considerarse más barato y más sostenible que la nitrificación/desnitrificación convencional. A pesar de las ventajas del proceso Anammox, todavía existen algunos aspectos importantes que deben ser estudiados a fin de mejorar sus posibilidades de implementación a escala industrial. Algunos de esos aspectos son el objeto de la investigación desarrollada en la presente tesis doctoral. Específicamente, la mejora de la retención de la biomasa en el interior de los reactores, la evaluación de los efectos de los posibles inhibidores del proceso y la aplicación del proceso en el rango mesofílico de temperatura. A continuación se resumen los contenidos principales de cada uno de los capítulos de la tesis: En el Capítulo 1 se realiza una revisión bibliográfica de la problemática de la eliminación de nitrógeno de las aguas residuales. También se lleva a cabo una descripción de las principales características del proceso Anammox y sus condiciones de operación. Seguidamente se incluyen análisis económicos de la eliminación de nitrógeno de las aguas residuales mediante diferentes tecnologías. Y para finalizar se realiza una discusión acerca de las perspectivas futuras de la eliminación de nitrógeno mediante el proceso Anammox. En el Capítulo 2 se detallan los materiales y métodos experimentales utilizados en la realización de los experimentos de los capítulos posteriores de esta tesis doctoral. Primero se explican los métodos empleados para analizar las propiedades de la fase líquida. A continuación de éstos, se incluyen las técnicas para la caracterización física y microbiológica de la biomasa. Finalmente, se detalla la composición del medio mineral Anammox. Este medio se usó como base para preparar la alimentación sintética de los reactores. En el Capítulo 3 se estudia la inhibición del proceso Anammox causada por sus sustratos (nitrito y amonio). Se asumió que las responsables de la inhibición eran las especies no ionizadas de los sustratos (amonio libre y ácido nitroso libre). Una ventaja de usar niveles mínimos de inhibición en términos de estos compuestos no ionizados es que la aplicación al control de diferentes sistemas Anammox operando en diferentes condiciones puede ser más sencilla. En una primera parte se determinaron los efectos inhibitorios a corto plazo de ambos sustratos mediante ensayos de actividad. Se utilizaron dos tipos diferentes de biomasa Anammox (biopelícula sobre soportes inorgánicos y lodo floculento). Se estimó un valor de IC50 (concentración que causa un 50% de inhibición) para el amonio libre de 35 mg N-NH3/L, sin diferencias significativas entre los dos tipos de biomasa usados. En el caso del ácido nitroso, el valor de IC50 para la biomasa en biopelícula fue de 11 µg N-HNO2/L. Sin embargo, la biomasa floculenta fue mucho menos resistente y su actividad específica fue inferior al 30% en presencia de sólo 4,4 µg N-HNO2/L. Seguidamente, se emplearon reactores SBR inoculados con biomasa en biopelícula para estudiar los efectos de la exposición a largo plazo. Se encontró que dichos efectos son más importantes que los observados durante la exposición a corto plazo. De ese modo, en presencia de 35-40 mg N-NH3/L y de 1,5 µg N-HNO2/L no se pudo conseguir la operación estable del reactor. El Capítulo 4 se dedica al estudio de los efectos de dos antibióticos de amplio espectro, como son el cloranfenicol y el hidrocloruro de tetraciclina, sobre el proceso Anammox. Este estudio tiene como finalidad conocer si es posible tratar con el proceso Anammox aguas procedentes de la digestión anaerobia de purines, las cuales se espera que contengan concentraciones de antibióticos relativamente elevadas. Inicialmente se determinaron los posibles efectos a corto plazo mediante ensayos de actividad y de biotoxicidad. Se encontró que ambos antibióticos producen un potente efecto inhibitorio y además, el hidrocloruro de tetraciclina causó un efecto de desactivación de la biomasa. Los ensayos de actividad Anammox y de biotoxicidad dieron similares valores de IC50 para el cloranfenicol, alrededor de 400 mg/L. Sin embargo, en el caso del hidrocloruro de tetraciclina, el IC50 calculado a partir de los ensayos de actividad fue de alrededor de 220 mg/L, muy superior a 94 y 42 mg/L, que fueron los valores de IC50 después de 5 y 15 min obtenidos con los ensayos de biotoxicidad. La diferencia entre los resultados de biotoxicidad a 5 y 15 min confirmaría el incremento de los efectos tóxicos de la tetraciclina con el tiempo. A continuación se investigaron los efectos a largo plazo añadiendo cada uno de los antibióticos a la alimentación de un reactor SBR Anammox. Se observó que 20 mg/L de cloranfenicol producían una disminución del 80% en la actividad Anammox. Efectos similares se observaron operando el reactor en presencia de 50 mg/L de hidrocloruro de tetraciclina. A pesar de la pérdida de actividad, los antibióticos no causaron cambios en las propiedades físicas de la biomasa, lo que permitió una buena retención de la biomasa. Puesto que la presencia de estos antibióticos fue perjudicial para la operación del proceso Anammox, en el capítulo también se discuten las posibles alternativas para su degradación previa. El proceso Anammox se ha operado en la gran mayoría de los casos, tanto en reactores de laboratorio como de tamaño industrial, para tratar aguas residuales a temperaturas próximas a 30 ºC. Estas aguas suelen proceder de tratamientos anaerobios operados en el rango mesófilo. En el Capítulo 5 se estudia la posibilidad de operar el proceso a temperaturas inferiores, lo cual permitiría su aplicación a aguas residuales de diferentes procedencias. En una primera etapa se estudiaron los efectos de la temperatura a corto plazo por medio de ensayos de actividad. Se encontró una tendencia de tipo Arrhenius con una energía de activación de 63 kJ/mol y el óptimo en el intervalo 35-40 ºC. A continuación se fue disminuyendo gradualmente la temperatura de operación de un reactor SBR Anammox con el fin de detectar una posible adaptación de la biomasa. El sistema fue operado eficientemente a 18 ºC, observando que la resistencia de la biomasa sometida en continuo a bajas temperaturas era mayor que la encontrada durante los ensayos de actividad. Sin embargo, cuando la temperatura de operación fue de 15 ºC, se empezó a acumular nitrito (sustrato limitante) en el medio de reacción y el sistema perdió su estabilidad. Finalmente, se estudió el tratamiento del sobrenadante de un digestor anaerobio a 20 ºC en un sistema con dos reactores SBR en serie, que llevaban a cabo la nitrificación parcial y el proceso Anammox. La carga nitrogenada global eliminada por el sistema fue de 0,08 g N/(L d). Después de investigar de forma independiente los efectos de los sustratos y la temperatura sobre el proceso Anammox, en el Capítulo 6 se emplea una herramienta estadística (modelos de superficie de respuesta) para evaluar la influencia combinada de distintas variables. En este caso se tomó la biomasa procedente de un reactor de deamonificación (proceso Anammox de una etapa en biopelícula) y se usó la actividad Anammox específica como variable de respuesta. Se seleccionaron como variables controladas la temperatura, el pH, la concentración de amonio, la concentración de nitrógeno total y la relación entre amonio libre y ácido nitroso. Se observó que los parámetros más importantes a la hora de optimizar la actividad Anammox eran la temperatura, el valor de pH y también la relación entre amonio libre y ácido nitroso. Además se encontraron sus intervalos óptimos. En función de esta información se propuso una estrategia de control para un reactor de deamonificación. Debido a la lenta velocidad de crecimiento de la biomasa Anammox y a su reducida productividad celular, es importante mantener una buena retención de la biomasa en el interior de los reactores. Esto es especialmente importante durante la puesta en marcha cuando se parte de una pequeña cantidad de inóculo. En este sentido, una de las alternativas que se han propuesto para la mejora de la retención de la biomasa Anammox es la formación de biopelículas. Los dos últimos capítulos de esta tesis se centraron en esta tecnología. En el Capítulo 7 se estudia la influencia del estrés mecánico y la salinidad en la formación de biopelículas Anammox. El desarrollo de las biopelículas se siguió mediante un sensor basado en las propiedades de vibración superficial. En general, se observó que la biomasa Anammox tiene una buena capacidad para formar biopelículas, durando la fase de adhesión inicial de la biomasa al soporte de 5-7 días para los tres diferentes caudales empleados (25,2; 8,4; 7,3 L/h) que correspondieron a la aplicación de flujos con Reynolds 188, 63 y 54. La estabilidad de la biopelícula fue mayor cuando se formó bajo condiciones de estrés mecánico más alto. Además se observó que la presencia de sales (NaCl, CaCl2) favorecía la formación de la biopelícula, debido a la reducción de las fuerzas de repulsión electrostática. Los efectos del CaCl2 fueron mayores que los causados por el NaCl probablemente debido a la formación de puentes catiónicos divalentes. En los dos casos se observó la incorporación de compuestos inorgánicos a la biopelícula. Finalmente, en el Capítulo 8 se estudia la puesta en marcha y operación de un sistema Anammox de biopelícula. Se eligió la zeolita natural como soporte para la biomasa, debido a su capacidad para adsorber amonio, que es uno de los sustratos consumidos por los organismos Anammox. De este modo, la biomasa en forma de biopelícula podría tener un mejor acceso al NH4+ y se fomentaría la formación de dicha biopelícula. Se observó que para promover la formación y crecimiento de la biopelícula Anammox era crucial mantener baja la concentración de amonio en el medio de reacción, de modo que la mayor parte de dicho sustrato se encontrara adsorbido sobre las zeolitas. Una vez que se logró que se desarrollara la biopelícula, la retención de biomasa que se alcanzó en el sistema fue muy buena, con concentraciones de sólidos en suspensión volátiles en el efluente inferiores a 3 mg SSV/L. Como consecuencia, la concentración de biomasa en el reactor se incrementó significativamente. Además, se logró una mejora en la actividad específica de la biomasa, alcanzando valores de hasta 0,5 g N/(g SSV d). La elevada densidad de las partículas de zeolita implicó la necesidad de aplicar una potencia de agitación relativamente elevada al medio de reacción, a fin de mantener dichas partículas en suspensión. Durante la puesta en marcha, la agitación aplicada podría producir una abrasión causada por partículas de zeolita no cubiertas, lo que tendría efectos perjudiciales para la biopelícula. Además, el estrés mecánico en si mismo podría causar un descenso en la actividad específica de la biomasa. Una vez que todas o la gran mayoría de las partículas se encontraron completamente cubiertas por biomasa, este problema se minimizó debido al descenso en la densidad global de las partículas y a la menor potencia de agitación necesaria. Además las partículas cubiertas por biopelícula tienen menor capacidad abrasiva. Debido a que el crecimiento de la biopelícula se consiguió cuando la concentración de amonio en el líquido se mantuvo relativamente baja, un reactor operando con esta tecnología debe alimentarse con una relación de sustratos próxima a la estequiométrica. Para conseguir esta relación el reactor de nitrificación parcial que produce el nitrito debe controlarse de forma cuidadosa. Esto puede resultar complicado durante los períodos de puesta en marcha. Un inconveniente adicional podría ser el hecho de que, teniendo en cuenta que el proceso Anammox puede ser inhibido por nitrito, tal como se demuestra en el Capítulo 3, la operación con un exceso significativo de amonio podría considerarse más segura, especialmente cuando las concentraciones en el influente no son muy estables. Sin embargo, debido a que una cantidad de amonio se encontrará adsorbida en el soporte sólido durante la operación, el sistema podrá actuar como un tampón de amonio y mitigar en cierta medida las sobrecargas por nitrito. De hecho, esta puede ser una de las principales ventajas del uso de las zeolitas como soporte de la biomasa, cuando se comparan con otras tecnologías Anammox de biopelícula (como los anillos Kaldnes), puesto que las zeolitas son una especie de soporte activo mientras que el plástico, vidrio y otros tipos de materiales no tienen esta capacidad. Con los trabajos realizados y expuestos en esta tesis doctoral se ha profundizado en el conocimiento de algunos de los aspectos clave del proceso Anammox como son su puesta en marcha y las condiciones de operación para mantener la estabilidad del sistema. Por lo tanto se considera que el conjunto de conocimientos obtenidos, que fueron resumidos a lo largo de la presente sección, facilitará la implantación industrial de dicho proceso para el tratamiento de diferentes aguas residuales. Objectives and summary This doctoral thesis is focused on biological treatment of wastewater and, specifically, on nitrogen removal. There are three main environmental problems caused by nitrogen pollution in aquatic ecosystems: it can decrease the pH of freshwater bodies without much alkalinity, leading to their acidification; it can stimulate or enhance the development and proliferation of photosynthetic organisms, resulting in eutrophication of aquatic ecosystems; and it can cause direct toxicity in aquatic life, leading to increased mortality and reproductive problems. In addition, nitrogen pollution of ground and surface waters can induce adverse effects on human health like acute toxicity, carcinogenesis, mutagenesis and allergies. Nitrogen is usually present in wastewater as ammonium. Biological conventional processes for nitrogen removal in wastewater treatment plants are based on nitrification and denitrification. Nitrification is the oxidation of ammonium firstly to nitrite and then to nitrate, by means of ammonium oxidizing bacteria and nitrite oxidizing bacteria, respectively. Total consumption of oxygen in order to convert ammonium into nitrate is about 4.2-4.5 g O2/(g NH4+-N). Furthermore, nitrification causes alkalinity consumption and 7.1 g CaCO3/(g NH4+-N) are necessary. This alkalinity can be already present in the wastewater to be treated or can be chemically added. The next step is the reduction of the nitrate and nitrite to nitrogen gas by means of denitrifying bacteria which use biodegradable organic matter as electron donor. However, there are some kinds of wastewater with low concentrations of biodegradable organic matter. In these cases an external biodegradable carbon source is necessary in order to obtain a complete denitrification, which implies an economic cost. Some typical external carbon sources are short chain alcohols (e.g. methanol, ethanol), acetate and glucose. Usually, methanol is the cheapest available carbon source, thus it is the most used compound. The need of organic matter per unit of mass of nitrogen is about 3.7 g COD/(g N) when methanol is employed. The use of technologies based on anaerobic ammonium oxidation (Anammox) is a relatively new alternative for nitrogen removal from wastewaters with low COD/N ratios. This process is carried out by autotrophic bacteria which, in anoxic conditions, combine ammonium and nitrite into nitrogen gas and a small amount of nitrate. Since nitrite is not usually present in wastewater, it will be necessary to oxidize about 50% of the ammonium into nitrite (partial nitrification). Partial nitrification and Anammox processes can be carried out in two different units. The first reactor is operated under aerobic conditions in order to convert approximately half of the ammonium in the influent into nitrite. The second reactor is the Anammox anoxic reactor where autotrophic denitrification is obtained. Partial nitrification and Anammox processes can also be carried out together in a single unit. This technology has received different names: CANON (Completely Autotrophic Nitrogen removal Over Nitrite); OLAND (Oxygen-Limited Autotrophic Nitrification-Denitrification) and deammonification. The main difference among them is that CANON process employs suspended biomass growing in a mixed reaction medium, while OLAND and deammonification are biofilm processes, thus biomass is growing on biodiscs or on moving plastic carriers, like Kaldnes rings. Dissolved oxygen concentration is the main operational variable to obtain a stable operation of the system. Diffusional limitations allow oxygen to be completely consumed in the outer layer of the granule or biofilm, the inner part being anoxic. Therefore, partial nitrification is carried out in the external part while Anammox bacteria will be growing in the inner layers. In any case and regardless of the reactor configuration, both processes, nitrification and Anammox, are autotrophic, thus biodegradable organic matter is not necessary. Besides, the requirements of oxygen are about 40% lower compared to conventional nitrification/denitrification because only 50% of the ammonium needs to be oxidized to nitrite. The production of sludge is also much lower due to the small biomass yield of the autotrophic organisms. Therefore partial nitrification/Anammox can be considered cheaper and more sustainable than conventional nitrification/denitrification. Despite the advantages of the Anammox process, there are still some important research issues which should be addressed in order to increase the chances to apply the Anammox process at full scale. Some of these issues are the focus of the research developed in the present doctoral thesis. Specifically, these topics are the improvement of the biomass retention in the reaction systems, the evaluation of the effects of the potential inhibitors of the process and the application of the process at the mesophilic range of temperature. Along the next paragraphs, the main contents of each chapter of the thesis are summarized: In Chapter 1, a literature revision about nitrogen removal from wastewater is done. Besides, the main characteristics and operational conditions of the Anammox process are described in detail. Economic analyses of different technologies for nitrogen removal from wastewater are also included. Finally, the future perspectives of nitrogen removal by Anammox are discussed. In Chapter 2, the materials and methods employed to carry out the experimental work of this doctoral thesis are explained. First, the methods employed to analyze the properties of the liquid phase are detailed. They are followed by the techniques for the physical and microbiological characterization of the biomass. Finally, the composition of the Anammox mineral medium is included. This medium was used to prepare the synthetic Anammox feeding. In Chapter 3, the inhibition of the Anammox process caused by its substrates (nitrite and ammonium) is studied. The unionized species of the substrates (i.e. Free Ammonia (FA) and Free Nitrous Acid (FNA)) were assumed to be the responsible for the inhibition of Anammox process. An advantage of using inhibition threshold concentration levels in terms of these unionized compounds is that their use in the control of different Anammox systems with varied conditions may be easier. In a first part, short time inhibitory effects were assessed by means of specific activity tests. Two different types of Anammox biomass (biofilm growing on inorganic carriers and flocculent sludge) were employed. The value of IC50 (concentration which caused 50% of inhibition) for FA was estimated about 35 mg NH3-N/L, without significant differences between the two kinds of biomass tested. In the case of FNA, the value of IC50 for biofilm biomass was about 11 µg HNO2-N/L. However, the flocculent biomass was much less resistant and its specific activity sharply decreased below 30% in the presence of only 4.4 µg HNO2-N/L. Subsequently, the study of the long-term effects was carried out in lab-scale Sequencing Batch Reactors inoculated with the biofilm biomass. It was found that the long term effects were more important than those observed at short term exposition. In particular, at concentrations of 35-40 mg NH3-N/L and 1.5 µg HNO2-N/L stable operation of the reactor was not reached. The aim of Chapter 4 is to assess if the Anammox treatment of wastewaters from anaerobic digestion of manure was possible. These wastewaters are expected to contain significant concentrations of antibiotics. Thus, this chapter is focused on the effects caused by two broad spectrum antibiotics (chloramphenicol and tetracycline hydrochloride) on the Anammox process. First, the short term effects were studied by means of activity and biotoxicity assays. It was found that both antibiotics produced strong inhibitory effects and besides, tetracycline hydrochloride caused deactivation of the biomass. Anammox activity and biotoxicity assays gave similar values of IC50 for chloramphenicol, about 400 mg/L. However, in the case of tetracycline hydrochloride, the IC50 calculated from activity tests was about 220 mg/L, much higher than 94 and 42 mg/L, which were the IC50 values at 5 and 15 min obtained by biotoxicity tests. The difference between biotoxicity results at 5 and 15 min would confirm the increase of the toxic effect caused by tetracycline along time. Subsequently, long term effects were researched adding each antibiotic to the feeding of an Anammox SBR reactor. It was observed that 20 mg/L of chloramphenicol caused 80% of decrease of the Anammox activity. Similar effects were observed when the reactor was operated in presence of 50 mg/L of tetracycline hydrochloride. Despite the loss of activity, both antibiotics did not cause changes in the physical properties of the biomass, which allowed good biomass retention. Since these antibiotics were negatively affecting the Anammox process, degradation technologies which could be used previously to the Anammox reactor are discussed in this chapter. The Anammox process has been usually operated, both at lab scale and industrial scale, to treat wastewaters at temperatures around 30 ºC. These wastewaters are usually the effluent of anaerobic digesters operated at the mesophillic range of temperature. In Chapter 5 the operation of the process at lower temperatures is studied in order to apply the process to different types of wastewaters. In the first part, the short term effects of temperature were studied by means of specific activity tests. An Arrhenius type trend was found with activation energy of 63 kJ/mol and the optimum activity at 35-40 ºC. The next part of the experiments consisted of the gradual diminution of the temperature of an Anammox SBR, in order to find a possible adaptation of the biomass. The system was efficiently operated at 18 ºC and the resistance of the biomass, which was slowly adapted to low temperatures, was higher than that observed during activity tests. However, when temperature of operation was 15 ºC, nitrite (i.e. limiting substrate) started to accumulate in the reaction medium and the system lost its stability. Finally, the supernatant of an anaerobic digester was treated at 20 ºC by means of a system with two SBR reactors in series, which were carrying out the partial nitrification and the Anammox process. The global nitrogen removal rate of this system was 0.08 g N/(L d). After researching independently the effects caused by the substrates and the temperature on the Anammox process, in Chapter 6 a statistical tool is employed (response surface models) in order to assess the combined influence caused by several variables. In this case the biomass samples were taken from a deammonification reactor (one-stage biofilm Anammox process) and specific Anammox activity was employed as response variable. Temperature, pH, ammonium concentration, total nitrogen concentration and free ammonia to free nitrous acid ratio were chosen as the controlled variables. It was observed that the significant parameters in order to optimize the process were the temperature, the value of pH and the ratio between free ammonia and free nitrous acid. Besides, the optimum ranges of these variables were found. Taking into account this information, a control strategy for a deammonification reactor was developed. Due to the slow growth rate and small biomass productivity of the Anammox process, it is important to mantain good biomass retention in Anammox reactors. This is especially important during start up when the amount of available inoculum is small. One of the alternatives studied to improve the retention of Anammox biomass was the use of biofilm reactors. The two last chapters of this thesis are focused on this technology. In Chapter 7 the influence of mechanical stress and salinity on formation of Anammox biofilms is studied. The development of the biofilms was monitored by means of a sensor based on surface vibration properties. It was observed that Anammox biomass has a good ability to form biofilms and the initial phase of adhesion to the support lasted about 5-7 days at the three different flow rates tested (25.2; 8.4; 7.3 L/h), corresponding to Reynolds numbers 188, 63 and 54. The stability of the biofilm was higher when it was formed under high mechanical stress. Besides, it was observed that the presence of salts (NaCl, CaCl2) enhanced the formation of the biofilm because of the reduction of electrostatic repulsion forces. The effects of the CaCl2 were stronger than those caused by NaCl probably because divalent cationic bridging was taking part when the calcium salt was used. Incorporation of inorganic compounds into the biofilm was observed in both cases. Finally, in Chapter 8, the start up and operation of an Anammox biofilm system is studied. Natural zeolite was employed as the biofilm support because this material is able to adsorb ammonium, which is one of the substrates consumed by the Anammox organisms. This would favour the access of attached biomass to NH4+ and, therefore, it would promote the biofilm formation. It was observed that it was very important to keep a low concentration of ammonium in the reaction medium in order to promote the formation and growth of the biofilm. In these conditions, the most part of the ammonium was adsorbed on the zeolites. Once the biofilm was established and developed, the retention of biomass in the system was very good, with volatile suspended solids concentrations in the effluent lower than 3 mg VSS/L. As a consequence, the biomass concentration in the reactor increased significantly. Besides, the specific activity of the biomass increased, reaching values about 0.5 g N/(g VSS d). The high density of zeolite particles implied the necessity of applying a high mixing power into the reactor to keep them in suspension. During the start-up period, the applied stirring power would promote abrasion produced by bare zeolite particles which can cause detrimental effects on biofilm. Furthermore, the shear stress by itself could cause a decrease on the biomass specific activity. Once the particles were fully covered with biomass this problem was minimized due to the decrease of global particle density and, therefore, lower mixing power was needed. Furthermore, particles covered by biofilm had lower abrasive capacity. Since the growth of biofilm was achieved when the ammonium concentration in the bulk liquid was relatively low, a reactor with this technology should be fed with a substrate ratio near to the stoichiometric one. In order to achieve this ratio, the previous partial nitrification reactor producing the nitrite should be carefully controlled. This might be difficult during the start up periods. One additional inconvenient might be the fact that, since Anammox can be inhibited by nitrite (according to Chapter 3), the operation with a significant excess of ammonium would be considered safer, especially if the influent concentrations are not very stable. However, since an amount of ammonium would be adsorbed on the solid support along the operation, the system may act like an ammonium buffer and nitrite overloads may be mitigated in some extent. Actually, this can be one of the main advantages of the use of zeolites when compared to other Anammox biofilm technologies (like biofilm on Kaldnes rings), since zeolites are a kind of active support while plastic, glass or other kinds of biofilm supports do not have that ability. With the different works carried out and reported along the present doctoral thesis, the knowledge about some of the key aspects of the Anammox process has been increased. Therefore it is considered that the obtained knowledge, which has been summarised along the present section, will make easier the industrial implementation of the process in order to treat different kinds of wastewaters.