Contribución al estudio epidemiológico de la brucelosis bovina en la Comunidad Autónoma de GaliciaInvestigación y aplicabilidad de nuevas técnicas diagnósticas

Resumo

En las fases finales de la erradicación de la brucelosis bovina, como es el caso de Galicia, se prioriza la detección temprana de los focos y la discriminación de las falsas reacciones negativas y positivas según que los animales procedan de focos activos de la enfermedad o de zona libres. Por tanto, el uso del test de diagnóstico más adecuado para cada situación epidemiológica puede suponer una reducción del período de erradicación junto con un descenso de los costes de los programas sanitarios. Para que la elección de los test sea adecuada y se manifieste el potencial de cada uno de ellos en situaciones determinadas es imprescindible que los laboratorios de diagnóstico de rutina garanticen un comportamiento óptimo de cada uno de ellos en sus condiciones de trabajo. La herramienta más adecuada para este fin lo constituye la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005. En este estudio se evaluaron diferentes test utilizados habitualmente en el diagnóstico serológico de la brucelosis bovina: aglutinación en microplaca con rosa de bengala, aglutinación en microplaca con rosa de Bengala y fijación de complemento utilizados en serie, dos ELISAs indirectos, y un ELISA competición. Esta evaluación incluyó un protocolo de verificación interna según la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005, una extensión de la validación aplicando un criterio de comparación absoluto, una extensión de la validación aplicando un criterio de comparación relativo y una evaluación del uso de los test de ELISA en diferentes situaciones epidemiológicas. En ambas extensiones de la validación se estimaron los parámetros de rendimiento más habituales de los test de diagnóstico como fueron la sensibilidad, la especificidad, los valores predictivos, las razones de verisimilitud, la eficiencia y el índice de rendimiento. En la extensión de la validación relativa se utilizó como test de comparación la aglutinación en microplaca con rosa de Bengala y la fijación de complemento aplicados en serie. Adicionalmente, se estimaron los índices Kappa correspondientes y las curvas ROC para los test de ELISA. Para la extensión de la validación se utilizaron muestras obtenidas durante la realización de una campaña de saneamiento ganadero en Galicia y se organizaron en siete grupos que representan las diferentes situaciones epidemiológicas que se obsevaron en las fases finales de la erradicación de la enfermedad: sueros positivos de animales con aislamiento, sueros de animales con conversión del título de annticuerpos, sueros positivos de animales sin aislamiento, sueros negativos de animales oficialmente indemnes, sueros negativos acompañantes de infectados, sueros con PA y sueros falsos positivos. En relación a la aglutinación en microplaca con rosa de Bengala y para los tres tipos de ELISA se elaboró un protocolo de verificación interna según los requisitos de la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005. La verificación interna incluyó estudios de exactitud y de precisión, esta última en condiciones de repetibilidad y de repetibilidad intermedia, mediante el uso de estándares de referencia, de estándares internos ajustados a los primeros y de muestras de campo positivas y negativas. Adicionalmente, para los test de ELISA se elaboraron dos tipos de gráficos para el seguimiento de la precisión en condiciones de repetibilida intermedia. Estos gráficos incluyeron la representación de los valores de los estándares de cada placa (gráficos DDD) y de los valores de los controles de las placas agrupados por días (gráficos SDC). En relación a los test, los valores absolutos y relativos obtenidos en la extensión de la validación pusieron de manifiesto la idoneidad de la aglutinación en microplaca con rosa de Bengala como test de cribado. En los focos activos de la brucelosis ninguno de los test fue capaz de detectar todos los animales positivos individualmente. También se observó que los test no clasificaban igual a todos los sueros. Por tanto, se recomienda el uso de los ELISAs indirecto y competición, en paralelo, en los focos activos de la infección. Para el ELISA competición se observaron limitaciones para su uso como test de confirmación debido a diferencias significativas de su especificidad. Este test, aunque no fue capaz de discriminar las reacciones cruzadas, fue el único capaz de detectar todos los animales positivos modificando el punto de corte, por lo que se recomienda su uso como test de confirmación en focos activos de la infección en substitución de la fijación de complemento. Uno de los ELISAs indirectos presentó diferencias significativas en la sensibilidad relativa en relación a los otros ELISAs y se desaconseja su uso en las campañas de saneamiento ganadero. Sin embargo, con los resultados obtenidos para el otro ELISA indirecto, se considera a este test como el más adecuado para una posible substitución de la aglutinación en microplaca con rosa de Bengala como test de cribado.