Tenacibaculosis en lenguado y rodaballoCaracterización morfológica y de la respuesta inmunitaria

Resumo

En la presente memoria se ha profundizado en el conocimiento de la tenacibaculosis que afecta al lenguado y al rodaballo, teniendo como principales objetivos el estudio de los aspectos relacionados con la morfopatología, el diagnóstico, la patogenia de la enfermedad y la respuesta de los peces frente a la infección. Con el fin de dar cumplimiento a estos objetivos se plateó en primer lugar el estudio histológico, ultraestructural e inmunohistoquímico de la piel sana, utilizando como modelo el rodaballo de cultivo, con el propósito de sentar las bases para una correcta interpretación de los resultados de los estudios morfopatológicos, así como de la respuesta inmune frente a la infección. Para ello, se emplearon rodaballos sanos y se tomaron fragmentos de piel dorsal y ventral de ejemplares que mostraban diferente coloración externa. Los resultados obtenidos mostraron que la piel del rodaballo presenta características morfológicas y estructurales similares a las descritas en la piel de la mayoría de los peces teleósteos, tanto bentónicos como pelágicos. Sin embargo, a diferencia de lo descrito en otras especies de peces, sólo se han identificado células goblet como células secretoras en la piel del rodaballo. Otro aspecto abordado en esta Tesis ha sido el análisis de la pigmentación de la piel del rodaballo, debido a sus importantes implicaciones biológicas y económicas. Los resultados indicaron que la coloración externa que presenta el rodaballo es reflejo de las variaciones en el número y tipo de cromatóforos presentes (melanóforos, xantóforos e iridóforos), así como de la distribución e interrelaciones que se establecen entre ellos. El segundo objetivo abordado ha sido la descripción de un síndrome ulcerativo observado en lenguado senegalés (Solea senegalensis) cultivado en Galicia. Este síndrome fue estudiado mediante técnicas histológicas, de microscopía electrónica de barrido (SEM), así como por métodos microbiológicos convencionales y moleculares. Los resultados de este estudio han permitido describir por primera vez las características y manifestaciones de la forma crónica de la tenacibaculosis causada por Tenacibaculum maritimum en el lenguado. La forma crónica de la enfermedad se caracterizaba por la presencia de 2-3 úlceras severas, localizadas principalmente en la zona central de las aletas dorsal y ventral de la piel del lenguado. Las úlceras alcanzaban las capas musculares donde se advirtió una pérdida total de epidermis y dermis, con necrosis de los paquetes musculares y un infiltrado inflamatorio compuesto principalmente por macrófagos. Además, la forma de cuña de las úlceras observadas en los peces enfermos eran indicativas de que la lesión se había iniciado en la superficie de la piel y había progresado después hacia capas más profundas llegando a afectar al músculo. Estos resultados suponen nuevas pruebas que señalan a la piel como una puerta de entrada para T. maritimum. En la periferia de estas lesiones, además de la pérdida de la epidermis, se observaba que los melanóforos se agregaban en la capa pigmentaria de la dermis causando una despigmentación local que podría explicar el aspecto blanquecino de los bordes de las lesiones, descrito como signo característico en peces afectados de tenacibaculosis. Otro de los resultados de interés de este estudio derivan del análisis de las muestras de lesiones severas de la piel mediante SEM. En estas muestras se observó una intensa ulceración de la región central de las escamas y la presencia de bacterias filamentosas en la superficie y entre los radios de las escamas. Las escamas, compuestas por una capa superficial que contiene hidroxiapatita y carbonato de calcio y una capa más profunda constituida fundamentalmente por colágeno, podrían actuar como una fuente de nutrientes para T. maritimum, particularmente de calcio y proteínas contribuyendo, por tanto, a su crecimiento y supervivencia. Con el objeto de desarrollar herramientas útiles y válidas para el diagnóstico y el estudio de la patogenia de la tenacibaculosis tanto en lenguado como en rodaballo se llevó a cabo la puesta a punto de una técnica de inmunohistoquímica (IHQ). Para ello, se emplearon muestras histológicas de lenguados procedentes de diferentes brotes de la enfermedad ulcerativa, ocurridos entre los años 2004 a 2005 y en los que se había aislado e identificado T. maritimum como agente causal de la infección. Paralelamente, se realizó una inoculación experimental en lenguados empleando la bacteria T. maritimum administrada por vía subcutánea. La toma de muestras se realizó a diferentes tiempos post-inoculación. Tras el sacrificio se realizó la necropsia y se tomaron secciones de la piel de todo el pez que también incluían hipodermis y musculatura, y muestras de bazo, riñón, branquias, hígado, timo, corazón, encéfalo y tracto gastrointestinal (esófago, estómago, ciegos pilóricos, intestino anterior, medio y posterior), que se fijaron y procesaron siguiendo los procedimientos habituales. Las secciones se recogieron en portaobjetos tratados con silane y se realizaron técnicas de tinción de rutina e IHQ, empleando un anticuerpo policlonal anti-T. maritimum purificado mediante cromatografía de afinidad. Los ejemplares retados con la bacteria se utilizaron como controles positivos de T. maritimum para la puesta a punto de las técnicas IHQ. Para el aislamiento y caracterización microbiológica mediante métodos convencionales y moleculares, se tomaron muestras de piel y órganos internos en condiciones asépticas y se sembraron en medios de cultivo generales, selectivos y diferenciales o se procesaron para la obtención y amplificación del ADN bacteriano y su posterior análisis mediante técnicas electroforéticas. Los resultados de este estudio demostraron que el antígeno bacteriano se localizaba en la piel y órganos internos de los lenguados afectados por el brote de la enfermedad ulcerativa y también en las muestras de tejido obtenidas a partir de los lenguados inoculados experimentalmente con T. maritimum. Este estudio permitió confirmar que la bacteria utiliza la piel como vía de entrada en el pez desde donde alcanza la circulación sanguínea y se distribuye hacia el resto de los órganos internos (forma septicémica). Además, la detección de los antígenos de T. maritimum en el lumen gastrointestinal de los lenguados que presentaron tenacibaculosis de forma natural, indicaría que este órgano puede actuar como reservorio de la enfermedad. A pesar de la repercusión que T. maritimum y otras bacterias filamentosas del género Tenacibaculum tienen para la industria acuícola, el modo de transmisión y la vía de infección continúan sin esclarecerse. Además, aunque se han llevado a cabo diferentes estudios encaminados a obtener un modelo experimental que permita reproducir la enfermedad, de manera similar a como se manifiesta en condiciones naturales, hasta el momento no se han obtenido resultados satisfactorios. Por otra parte, los mecanismos de defensa que se activan específicamente frente a T. maritimum no se conocen con exactitud. Por todo ello, en el presente trabajo de investigación, se evaluaron dos modelos de infección experimental en rodaballo mediante inyección subcutánea e intraperitoneal, con el propósito de profundizar en el conocimiento de la patogenia y de la respuesta inmune del rodaballo frente a la infección. En primer lugar se infectaron experimentalmente rodaballos mediante inyección subcutánea de 0,1 ml de una suspensión de T. maritimum (108 ufc/pez). En el segundo modelo experimental se utilizó la vía intraperitoneal para la inoculación y se testaron dos suspensiones de T. maritimum diferentes (109 ufc/pez y 108 ufc/pez). En todos los ensayos, los grupos de peces control se inyectaron por la vía estudiada, con 0,1 ml de solución salina estéril. La toma de muestras se realizó a diferentes tiempos post-inoculación. En primer lugar, se extrajo la sangre de los peces mediante punción de la vena caudal y, tras el sacrificio, se realizó la necropsia y se procedió a la toma de muestras de piel de que también incluían hipodermis y musculatura, bazo, riñón, branquias, hígado, timo, corazón, encéfalo y tracto gastrointestinal. Las muestras se procesaron para la realización de estudios histopatológicos y de IHQ. El cuadro histológico y el estudio de la distribución antigénica permitió demostrar que ambas vías pueden ocasionar la forma septicémica de la tenacibaculosis aunque con diferente patrón de distribución. Además, la distribución sistémica del antígeno ocurrió de manera más rápida en la vía subcutánea, y fue la única capaz de reproducir las lesiones ulcerativas características de la enfermedad. Por otro lado, los hallazgos en este experimento mostraron similitudes evidentes con la infección natural y experimental en lenguados. Además, la necrosis severa de la dermis, hipodermis y musculatura que caracteriza la enfermedad en rodaballo y lenguado y la observación del antígeno de T. maritimum siguiendo el soporte fibrilar de la hipodermis y del perimisio, sugieren la participación de los productos extracelulares bacterianos, que poseen alta actividad proteolítica, en el desarrollo de las lesiones. Finalmente, se emplearon técnicas de IHQ para la evaluación del número y distribución de las células Ig+ en rodaballos infectados experimentalmente con T. maritimum. Paralelamente, se examinaron los cambios en el valor hematocrito y en los leucocitos circulantes de los rodaballos inoculados experimentalmente. En este estudio se emplearon las muestras histológicas y sanguíneas del grupo de rodaballos inoculados por vía subcutánea. Los resultados obtenidos indican que la infección por T. maritimum en el rodaballo induce una respuesta inmune humoral que implica cambios en el número y distribución de células Ig+ así como modificaciones en los valores hematológicos en sangre periférica.