Desarrollo de métodos bioquímicos para la detección de ficotoxinas

Resumo

Las ficotoxinas, son productos naturales que pueden llegar al hombre u otros organismos por vía alimentaria, en forma de aerosol o por contacto directo con el agua, provocando efectos graves tanto a nivel sanitario como económico. Actualmente, y hasta el 2014, en la Unión Europea coexisten dos métodos oficiales para la detección de ficotoxinas lipofílicas: por un lado el bioensayo, poco específico y moralmente cuestionable; y por otro el LC-MS/MS (cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem), técnica costosa, que requiere personal especializado e incapaz de detectar compuestos que no hayan sido caracterizados o de los que no existan estándares disponibles. Debido a los inconvenientes de ambas técnicas y a la continua aparición de nuevas toxinas; el desarrollo de métodos de detección rápidos, sensibles y fiables, que complementen a los métodos oficiales de referencia existentes, se hace cada vez más necesario. Atendiendo a estas necesidades, en la presente tesis se han desarrollado métodos bioquímicos para la detección de iminas cíclicas y azaspirácidos empleando técnicas luminométricas (absorbancia, luminiscencia, fluorescencia) y el sistema Luminex. Ambas técnicas permiten detectar uniones moleculares y proporcionan ciertas ventajas con respecto a los métodos oficiales ya que no usan animales, resultan específicas y económicas, y no requieren personal especializado. Los resultados obtenidos permiten concluir lo siguiente: 1) El ensayo de inhibición desarrollado para la detección de iminas cíclicas basado en la competición de estas toxinas con la alfa-bungarotoxina por la unión a los receptores nicotínicos de acetilcolina, es capaz de detectar tanto espirólidos como gymnodimina en la carne de molusco ofreciendo distintas modalidades de detección. Además la optimización del ensayo quimioluminiscente, permite usar esta técnica como método de criba de alto rendimiento para analizar un mayor número de muestras por placa, disminuyendo los costes e incrementando la flexibilidad para la organización del trabajo de laboratorio. 2) La inhibición de la unión entre la alfa-bungarotoxina y las proteínas de unión a acetilcolina (nAChRs y L-AChBP) por parte de espirólidos y gymnodimina, puede usarse para detectar la presencia de estas toxinas en moluscos usando la plataforma de multidetección Luminex. Esta técnica, más sensible que las anteriores, emplea un sencillo protocolo de extracción con acetona que permite la preparación simultánea de gran número de muestras y la posibilidad de incluir a estas toxinas en un método de multidetección y 3) El método de detección de azaspirácidos basado en el uso de la plataforma de multidetección Luminex, puede utilizarse como método de criba usando una extracción con metanol/acetato, ya que detecta concentraciones inferiores al límite regulador establecido en Europa para estas toxinas. Este método presenta características adecuadas para ser incluido en el futuro en un método de multidetección.