Obtención de un microorganismo productor de quimosina de búfalo con aplicabilidad biotecnológica

Zusammenfassung

INTRODUCCIÓN Las proteasas son enzimas capaces de catalizar la ruptura de enlaces peptídicos. Las aplicaciones de las proteasas en la industria alimentaria junto con su vasta diversidad y su amplio rango de acción han atraído la atención de los biotecnólogos en todo el mundo. Aunque están ampliamente distribuidas en la naturaleza, los microorganismos son la fuente preferente de estos enzimas para llevar a cabo bioprocesos de fermentación, debido a su bajo coste de producción, a su alta tasa de crecimiento y también por ser susceptibles de manipulación genética lo cual permite la mejora de su producción enzimática o la posibilidad de modificar los enzimas que producen para obtener nuevas y mejores actividades (Mala Rao et al., 1998; North, 1982). Entre la gran cantidad de proteasas con aplicación en la industria alimentaria se encuentran las proteasas aspárticas, empleadas tradicionalmente para la elaboración de masas queseras. Estas proteasas, presentan dos residuos de acido aspártico y una conformación tridimensional bilobulada, características que les confieren su capacidad para actuar específicamente sobre el enlace Phe105-Met106 presente en la casein de la leche, originando la coagulación de la leche (McMahon et al., 1984), Las proteasas aspárticas se pueden dividir en dos grandes grupos: proteasas tipo pepsina, que, además de las pepsinas animales incluyen las fúngicas producidas por especies de los géneros Aspergillus, Penicillium, Rhizopus o Neurospora y proteasas tipo renina encuadradas dentro del grupo E.C.3.4.23.4. Este último grupo de las reninas es el más solicitado por originar masas queseras idóneas. En la actualidad, existen tres fuentes principales de reninas empleadas en la industria quesera. En primer lugar las reninas animales tales como las quimosinas (EC. 3. 4. 23. 4), extraídas tradicionalmente a partir del prensado directo de cuajares de terneros lechales. En segundo lugar las reninas microbianas, obtenidas mediante la extracción de sobrenadantes de cultivos de Endothia o Mucor y, por último, las reninas obtenidas mediante ingeniería genética. En general, la incapacidad de las quimosinas animales para cubrir las demandas actuales de cuajo en la industria quesera, ha conducido a un aumento del interés por las reninas microbianas y las recombinantes. Una gran variedad de bacterias y hongos han sido descritas como productoras de enzimas microbianos capaces de coagular la leche originando masas queseras, como los géneros Alcaligenes, Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Pseudomonas, Serratia, Streptococcus o Streptomyces, Aspergillus (Reichard, 1995), Candida (Monod, 1994), Coriolus, Endothia, Enthomophtora, Irpex, Mucor, Penicillium (Gente et al., 1997), Rhizopus, Sclerotium, Torulopsis (Yu, 1994), Saccharomyces cerevisiae (Egel-Mitani et al., 1989) y Phaffia (Bang et al., 1999). Sin embargo, sólo dos de estos dos géneros se usan en la actualidad en la industria; Mucor (Sternberg, 1972; Gagnaire et al., 2001) y Endothia (Gray et al., 1986; Dickinson et al., 1987). En general, muchas proteasas aspárticas de origen microbiano se han introducido en el mercado pero sin éxito (Yu, 1994). Diversos genes de proteasas aspárticas de bacterias y hongos han sido expresados en otros microorganismos. Así, Gray et al., (1986), expresan una proteasa aspártica de M. miehei en E. coli y Aspergillus nidulans. Más tarde, Dickinson et al., (1987), introdujeron un gen de una proteasa aspártica de Mucor miehei en Mucor circinelloides. Lin et al., (1993), clonaron y expresaron un gen de una proteasa aspártica de Candida tropicalis en E. coli. y Reichard et al., (2000), expresaron un gen de una proteasa 2 aspártica de Aspergillus fumigatus en P. pastoris. Incluso, existen trabajos que describen la clonación de proteasas aspárticas de plantas en microorganismos (Cordeiro et al., 1994), como la clonación de la ciprosina de Cynara cardunculus en P. pastoris (White et al., 1999). En 1982, Harris et al. and Moir et al., secuencian y clonan la preproquimosina, de origen animal. Más tarde, la quimosina animal se clonó y expresó con éxito en E. coli (Nishimori et al., 1982; Emtage et al., 1983; Zhang et al., 1991) y, más adelante, en levaduras como Saccharomyces (Mellor et al., 1983; Goff et al., 1984; Smith et al., 1985), Klyveromyces (Van der Berg et al., 1990; Geoffroy et al., 1990) ó Yarrowia (Franke et al., 1988), así como en ciertas especies de Bacillus (Parente et al., 1991; Hayashi et al., 1995), Aspergillus (Cullen et al., 1987; Tschiya et al., 1993) ó Trichoderma (Harkki et al., 1989). Es en 1988 cuando, Genencor, introduce por primera vez en el mercado cuajo obtenido a partir de un cepa recombinante de E. coli portadora del gen de la quimosina del ternero, más tarde clonado y expresado con éxito en levaduras. Esto representó el primer eslabón de una cadena que, según los expertos en Biotecnología, tiene como finalidad reemplazar paulatinamente el cuajo animal por el obtenido a partir de microorganismos recombinantes (Green, 1985; Hicks et al., 1988). Tras varios años de estudios relacionados con este tema (Poza et al., 2003; Poza et al., 2004), los cuales originaron una serie de microorganismos recombinantes portadores de genes de proteasas aspárticas de origen microbiano, nos planteamos clonar el gen de la quimosina del búfalo (Bubalus arnee bubalis). Las razones de este planteamiento son: 1. La necesidad de buscar nuevas fuentes de producción de cuajo. 2. El búfalo contiene en su genoma un gen altamente homologo (97 %) al de la quimosina del ternero y, además, el solapamiento de ambas proteínas en base a su estructura tridimensional muestra un elevado grado de similitud, no encontrándose diferencias conformacionales entre los centros activos (spdviewer). 3. La quimosina del ternero ha sido clonada anteriormente con éxito en bacterias y levaduras, obteniéndose la cepa recombinante de E. coli que actualmente se emplea en la industria quesera. 4. El gen de la quimosina ha demostrado mayor eficacia en la industria quesera que cualquier otra proteasa aspártica microbiana o fúngica, de ahí que sólo se haya comercializado con éxito una cepa recombinante; una cepa de E. coli que contiene el gen de la quimosina bovina. Las granjas de búfalo están prosperando en la actualidad por ser las hembras capaces de producir un tipo de leche ideal para elaborar queso Mozzarella. Sin embargo, la quimosina del búfalo, de 36 kDa, no ha sido explotada industrialmente para elaborar queso (Mohanty et al., 2003; Malak et al., 1996), aunque el gen de la quimosina del búfalo (Bubalus arnee bubalis) ha sido aislado y secuenciado. Este gen se encuentra en el GenBank y su número de acceso es; AF177290. Este gen guarda una homología del 97 % con el gen de la quimosina de Bos taurus. Esto permite diseñar parejas de oligonucleótidos a partir de ambas secuencias para llevar a cabo la amplificación del gen que se va a clonar. 3 Se propuso, por tanto, aislar el gen de la quimosina de Bubalus arnee bubalis (búfalo), a partir de la extracción de mRNA del cuajar de un individuo lechal, utilizando un sistema de RT-PCR. El gen obtenido fue clonado y expresado en E. coli, basándonos en anteriores estudios. Y, dado el éxito alcanzado en numerosas ocasiones en la expresión de proteínas heterólogas en levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (Sreekrishna, 1997; Cereghino et al., 2002; Brouta et al., 2002; Waterham et al., 1997; Reichard et al., 2000; White et al., 1999; Goff et al., 1984; Mellor et al., 1983), se realizó la clonación posterior del gen en estos microorganismos, con el fin de obtener finalmente una levadura recombinante productora de cuajo, capaz de competir con los productos que actualmente oferta la industria quesera. OBJETIVOS Objetivo 1; Aislamiento del gen de la quimosina de Bubalus arnee bubalis. Extracción del cuajar del búfalo . El búfalo macho debe haber sido alimentado exclusivamente con leche materna, durante 15 días. Inmediatamente después de la matanza se extrajo el cuajar que fue troceado y congelado a -80ºC, empleando nitrógeno liquido, en presencia de estabilizadores e inhibidores de RNasas. Análisis de la quimosina del cuajar de búfalo. A partir de un machacado directo del cuajar del búfalo se extrajo un concentrado enzimático libre de células mediante centrifugación y posterior filtración. Así, se llevarán a cabo ensayos de coagulación sobre leche con la idea de evaluar la eficacia del enzima para elaborar masas queseras. Asimismo, se realizarán ensayos bioquímicos empleando diversos inhibidores de proteasas, permitiéndonos de este modo atribuir la actividad coagulante a una proteasa aspartica. Extracción de RNA total a partir de un cuajar de Bubalus arnee bubalis. La extracción de RNA a partir de las muestras congeladas se llevó cabo usando el RNAeasy Mini Kit (Qiagen). Todas las superficies, material, tampones y reactivos deben estar libres de RNasas. Para ello se emplearon detergentes y DEPC (dietilpirocarbonato). En primer lugar se lisó el tejido usando un potterdespués se homogeneizó usando unas columnas Qiashredder spin column (Qiagen). Y A continuación se procedió a la extracción, lavado y elución del RNA, tal como indican las instrucciones para la extracción de tejidos animales. Electroforesis, cuantificación y estimación del grado de pureza del RNA extraído. Antes de realizar la amplificación del gen se hace necesario evaluar su grado de pureza para descartar una posible contaminación con DNA, que interferiría en el proceso de RT-PCR. Para ello, el RNA extraído fue cuantificado y evaluado en un espectrofotómetro a 260 nm. A continuación, se visualizó el RNA en un gel con formaldehído. Todo el material y reactivos necesarios para llevar cabo la electroforesis fueron tratados con DEPC. 4 Diseño de oligonucleótidos para la amplificación del gen de la quimosina del búfalo a partir de RNA. Los oligonucleótidos que se usaron para la amplificación del gen de la quimosina de búfalo fueron diseñados a partir de la secuencia del gen de la quimosina de Bubalus arnee bubalis (Código de acceso del GenBank; AF177290), así como a partir del gen de la quimosina aislado a partir de Bos taurus (Código de acceso del GenBank; NM_180994), ya que el grado de homología entre ambos genes es del 97 %. Estos datos nos permitirá diseñar oligonucleótidos flanqueando los extremos de la preproquimosina, de la proquimosina y de la quimosina. Amplificación del gen de la quimosina del búfalo a partir del RNA extraido. La amplificación del gen de la quimosina del búfalo se llevó cabo a partir del RNA obtenido, previamente tratado con DNasas, y los oligonucleótidos diseñados tal como se describe en el apartado anterior. Se utilizarán Retrotranscriptasas y Polimerasas que conducirán a la trascripción previa del RNA a cDNA, seguida de una amplificación del cDNA. El cDNA obtenido fue cuantificado y visualizado mediante electroforesis. Se evaluó, asimismo, su grado de pureza. Objetivo 2; Clonación y expresión del gen de la quimosina del búfalo en E. coli. En primer lugar, se realizó la clonación y expresión del gen amplificado en E. coli, por ser esta bacteria susceptible de manipulación genética, por ser de crecimiento rápido y por el bajo coste de su cultivo. Utilizamos, para la expresión del gen los vectores pUC19 y pET12 para su posterior expresión. Clonación del gen de la quimosina del búfalo en el vector pCR-Blunt-II-TOPO. Con el objeto de clonar los genes amplificados (preproquimosina, proquimosina y quimosina) de forma rápida y sencilla se utilizó el PCR Blunt II TOPO PCR Cloning Kit.Las moléculas, con extremos romos se ligaron, de esta manera, en el vector pCRBlunt II-TOPO para luego transformar una cepa de E. coli TOP10. Este sistema de clonación permite la posterior ingenierización de las moléculas a otros vectores con relativa facilidad, además de que facilita la secuenciación del inserto, indispensable para comprobar su naturaleza. Subclonación del gen de la quimosina del búfalo en los vectores pUC19 y pET12. Con el fin de expresar la quimosina del búfalo en E. coli, los insertos librados del vector pCR-Blunt II-TOPO, empleando enzimas de restricción adecuadas, fueron subclonados posteriormente en los vectores pUC19 y pET12 en la orientación idónea, con respecto al promotor. Las construcciones obtenidas serán empleadas para transformar las cepas correspondientes de E. coli donde se analizará la expresión, mediante inducción con IPTG. Análisis de la expresión del gen de la quimosina del búfalo en E. coli. 5 Las cepas de E. coli recombinantes portadoras del gen de la preporquimosina, proquimosina y quimosina fueron cultivadas en presencia de IPTG para analizar su expresión. Los niveles de expresión fueron evaluados en el interior celular, en el periplasma y en el sobrenadante. Además, se realizaron ensayos de activación mediante acidificación/neutralización. No se encontró actividad coagulante en ninguno de los clones obtenidos. Objetivo 3; Clonación y expresión del gen de la quimosina del búfalo en levaduras. Las levaduras han demostrado ser excelentes hospedadoras para la expresión de proteínas heterólogas. Así, nos planteamos la clonación y expresión del gen de la quimosina del búfalo en levaduras. Elección del huésped. En un principio nos planteamos la clonación y expresión de las secuencias codificantes para la preproquimosina, proquimosina y quimosina de búfalo en dos levaduras, Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae. Pero tras los buenos resultados obtenidos con la P. pastoris decidimos centrarnos y tratar de mejorar la expresión en esta levadura. Con esta levadura conseguimos obtener quimosina en estado activo en el sobrenadante sin necesidad de activación previa. Clonación y expresión del gen de la quimosina del búfalo en Pichia pastoris empleando el vector pGAPZ¿. Con este vector se construyó una fusión traduccional bajo el promotor constitutivo pGAP, que constó del péptido señal del factor ¿ de S. cerevisiae que facilita la secreción al exterior celular y una de las tres secuencias clonadas previamente en el vector pCR Blunt II TOPO (preproquimosina, proquimosina o quimosina). Una vez obtenidas las diferentes construcciones en E. coli se transfirieron a P. pastoris integrando la construcción en su genoma. La construcción portadora de la secuencia de la proquimosina consiguió niveles de expresión muy superiores a los de la construcción realizada con la preproquimosina ya que en este caso no fue preciso concentrar el sobrenadante. En cuanto a la construcción realizada con la quimosina no fue activa. Caracterización bioquímica de la quimosina de B. arnee bubalis expresada en P. pastoris. Se determinaron los parámetros cinéticos (Km y Vmax), los valores de pH y temperatura óptimos de actuación del enzima empleando el método diseñado por Ageitos et al. (2006). La determinación del peso molecular se realizo por electroforesis empleando para ello un patrón de pesos moleculares. Clonación y expresión de la proquimosina del búfalo en Pichia pastoris empleando el vector pHIL-S1. 6 Con este vector se construyó una fusión traduccional bajo el promotor inducible AOX1, que constó de un péptido señal que facilita la secreción al exterior celular (péptido señal del gen PHO1) y la secuencia correspondiente a la proquimosina de búfalo. Clonación y expresión de la proquimosina del búfalo en Pichia pastoris empleando el vector pPICZ¿. Con este vector se construyo una fusión traduccional bajo el promotor inducible AOX1 que consto de un péptido señal que facilita la secreción al exterior celular (péptido señal del factor ¿ de S. cerevisiae) y la secuencia correspondiente a la proquimosina de búfalo. Analisis comparativo de la producción de proquimosina entre los diferentes clones de P. pastoris obtenidos. Una vez probadas estas tres alternativas diferentes para la expresión de la proquimosina (pGAPZ¿, pHIL-S1, y pPICZ¿), se eligió la construcción realizada con el vector pGAPZ¿. Esta construcción fue la que presento mayor nivel de expresión de proquimosina Objetivo 4; Mejora de la producción de la proquimosina clonada en el vector pGAPZ¿ y expresada en P. pastoris. Optimización del proceso de fermentación. Para optimizar el proceso de fermentación se determinaron la temperatura y aireación óptima en matraz para posteriormente optimizar un proceso de fermentación con adición en continuo de glucosa elevando de este modo la densidad celular de cultivo y la actividad enzimática en el sobrenadante Optimización de la expresión. Para mejorar los niveles de expresión se actuó a dos niveles. El primero de ellos consistió en incrementar la dosis génica (numero de cassettes de expresión). Para conseguir esto se retransformó una cepa que ya contiene en su genoma un cassette de expresión con la misma construcción. Al utilizar cantidades crecientes del factor de selección, se seleccionan de este modo los clones más resistentes. Estos clones más resistentes tendrán más copias del gen. Con esta estrategia no se obtuvieron mejoras en la actividad enzimática. El segundo nivel de actuación consistió en la optimización del uso de codones por mutagénesis dirigida. Con esta estrategia se consiguió duplicar la actividad enzimática obtenida en el sobrenadante. Objetivo 5; Análisis comparativo entre la actividad coagulante del Chymax y el sobrenadante de cultivo de una cepa productora de quimosina de búfalo. La comparación entre la actividad coagulante del Chy-max y la quimosina recombinante de búfalo se efectuó en base un análisis físico-químico de las masas queseras elaboradas con ambas quimosinas y a una comparación de la actividad 7 enzimática por el método descrito por Ageitos et al. (2006). El cuajo de búfalo recombinante es totalmente equiparable al cuajo comercial por lo que sería perfectamente utilizable en la industria quesera. En cuanto a la actividad enzimática, el Chy-max mostró una actividad enzimática tan solo 24 veces superior al sobrenadante de cultivo de la cepa recombinante de P. pastoris sin concentrar. Estos resultados hacen que podamos tener en cuenta este nuevo producto biotecnológico procedente de P. pastoris como una seria alternativa al producto dominante del mercado mundial de cuajos para la elaboración de queso.