Desarrollo de experimentos y aplicaciones de RMN dirigidas al estudio de metabolitos y sus interacciones supramoleculares

Zusammenfassung

La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) ha probado ser una de las herramientas más versátiles en química y bioquímica. Permite conocer estructura, dinámica e interacciones moleculares tanto de pequeñas moléculas de origen sintético o metabólico como de biomoléculas de gran tamaño. Los estudios de RMN pueden realizarse en disolución (RMN de líquidos) en estado sólido o semi-sólido, e incluso, aunque es mucho menos común, en sistemas gaseosos. Comparada con otras técnicas espectroscópicas, la RMN adolece de una inherente baja sensibilidad expresada como relación señal-ruido, por lo que gran parte del esfuerzo en el desarrollo instrumental y metodológico ha estado encaminado hacia el aumento de ésta a través de la fabricación de imanes de mayor campo, la creación de sondas específicas para cada núcleo y criosondas, secuencias de pulsos que utilizan detección inversa del heteronúcleo, etc. Gracias a las mejoras conseguidas, no es inusual conseguir muestras con sensibilidad por scan suficiente. La segunda limitación es el elevado tiempo que requiere el muestrear la señal hasta obtener la resolución necesaria en todas las dimensiones espectrales, problema que se hace patente en la espectroscopía multidimensional, donde los tiempos de adquisición son mucho mayores conforme aumentan el número de puntos a muestrear en las llamadas dimensiones indirectas. Recientemente, se han propuesto varias estrategias para solventar esta segunda limitación. De manera muy general, éstas se pueden dividir en tres grandes grupos; experimentos con muestreo reducido, experimentos de pulsado rápido y experimentos con tiempo compartido (una ampliación sobre estas tres estrategias se expone en el capítulo 1). En esta Memoria se exploran dos de estos grupos, presentándose una estrategia de aceleración de experimentos mediante el pulsado rápido (Fast-PRE-NMR, capítulo 2) y una estrategia de acelerado de adquisición de experimentos mediante la detección en paralelo, perteneciente al grupo de los experimentos con tiempo compartido (PALSY-NMR, capítulo 3). Además de las limitaciones mencionadas sobre sensibilidad y tiempo requerido para obtener espectros multidimensionales, cuando se utiliza la RMN para estudiar mezclas complejas de compuestos de bajo peso molecular de origen diverso, biológico (metabolitos), alimentario, industrial, química combinatoria etc., o incluso en mezclas más simples de composición conocida, como las utilizadas en el estudio de las interacciones de pequeñas moléculas con grandes moléculas diana, es frecuente encontrarse con problemas de congestión de señales en los espectros, lo que introduce dificultades para su asignación y/o integración. Algunas de las soluciones planteadas para simplificar este tipo de espectros consisten en introducir, dentro de la secuencia de pulsos original del experimento, algún módulo adicional para el filtrado de señales. El filtrado opera de acuerdo con alguna propiedad que sea lo suficientemente diferente entre las señales de RMN de las moléculas de la mezcla, de forma que finalmente se consiga un espectro en el que tengan mayor preponderancia (intensidad) las señales de la/s molécula/s de interés. En esta Memoria se presenta un nuevo tipo de filtrado de señal basado en una propiedad como es el coeficiente de difusión molecular y que se ha denominado filtro de difusión reverso (filtro Drev, capítulo 4). Otra posibilidad que se plantea en esta Memoria para reducir el solapamiento de señales es extender una idea, originalmente propuesta para espectros de protón, al experimento de transferencia de saturación (STD-NMR), uno de los más utilizados para detectar interacciones intermoleculares. El método se basa en la transformación de espectros 2D J-resueltos a 1D-Homodesacoplados en los que la multiplicidad de las señales del espectro se simplifica a singletes (1D-STD-homodesacoplado, capítulo 4). En el estudio por RMN de mezclas complejas como alguna de las mencionadas arriba, incluso con los diferentes métodos disponibles para separar señales o simplificar los espectros no suele ser suficiente. Normalmente la identificación de señal al nivel molecular requiere disponer de información adicional, proveniente de RMN y otras técnicas de análisis, y que idealmente puede venir sistematizada en forma de base de datos de los compuestos que son habituales para el tipo de muestra en cuestión. Frente a las dificultades que esto introduce, se ha planteado el término ¿huella dactilar de metabolitos¿ , con la intención de poder clasificar de forma rápida y efectiva entre diferentes muestras, en función de patrones de similitud que presentan sus espectros de RMN, identificando similitud en el patrón espectral con similitud en la composición de la mezcla. Los crudos son un ejemplo de este tipo de muestra compleja de origen geológico para la que es relevante su clasificación de cara a su posterior refinado. En el capítulo 5 de esta Memoria se exploran diversos métodos estadísticos y se exponen un conjunto de aplicaciones informáticas desarrolladas para la clasificación automática de espectros de RMN mono- o multidimensional. Se recogen los resultados obtenidos al clasificar por estos métodos una serie de muestras de crudo de diferente procedencia geográfica. Esta Memoria está estructurada en cinco capítulos; el primero es una introducción general a los diferentes métodos de FAST-NMR, y cada uno de los siguientes corresponde al desarrollo de los temas comentados en esta introducción general. Se incluye en todos los casos una introducción al estado actual del tema a tratar. *Ellis, D.I.; Dunn, W.B.; Griffin, J.L.; Allwood, J.W.; Goodacre, R., ¿Metabolic fingerprinting as a diagnostic tool¿, Pharmacogenomics, 2007, 8, 1243-1266.