Utilidad de la detección de anticuerpos para el diagnóstico de infecciones parasitarias en équidos

Resumo

La información de que dispone sobre los parasitismos en caballos es limitada y sesgada hacia las infecciones por nematodos gastrointestinales estrongilados. Con objeto de solucionar esta situación en el Noroeste de España, se planteó un primer ensayo para conocer con exactitud las principales helmintosis parasitarias del ganado equino en una zona con clima oceánico (NO España). El análisis de muestras fecales de 418 caballos, utilizando técnicas copromicroscópicas (flotación, sedimentación, migración larvaria y coprocultivos) mostró que el 1% tenían cestodos (Anoplocephala perfoliata), 11% ascáridos (Parascaris equorum), 89% nematodos gastrointestinales (Trichonema, Gyalocephalus spp., Strongylus y Triodontophorus) y 3% oxiúridos. Teniendo en cuenta la edad de los caballos, se apreció influencia en la prevalencia de parascariosis, obteniéndose los valores más elevados en los potros menores de 3 años. La prevalencia de estrongilosis fue significativamente superior en caballos menores de 10 años, posiblemente debido a la inmunidad natural adquirida con el paso del tiempo. El mantenimiento de los caballos Pura Raza Galega (PRG) en condiciones extensivas (montes), con un manejo inapropiado, parece ser la principal causa de la mayor prevalencia de parascariosis y estrongilosis, al contrario de lo observado para los ejemplares de Pura Raza Español. Otra posible interpretación pasaría por considerar el valor económico de los caballos, que favorece la administración de cuidados adecuados (alimentación, desparasitación) en los Caballos de Deporte Español (CDE). Sin embargo, esta hipótesis se pone en duda al observar que los Pura Sangre Inglés y los PRE alcanzaron prevalencias elevadas de nematodosis gastrointestinales. Las yeguas mostraron mayores porcentajes de infección por ascáridos y estrongilados. Es interesante destacar que los estudios basados en el análisis de la eliminación de huevos de parásitos a través de las heces de los equinos puede presentar una dinámica estacional. Con el propósito de determinar la utilidad de una prueba ELISA con antígenos de excreción/secreción de larvas 2 de Gasterophilus spp., se diseñó un segundo estudio que consistió en establecer la cronobiología de este parásito, y su distribución entre caballos de Galicia. Para conseguir el primer objetivo, con periodicidad mensual se tomaron muestras de sangre de un rebaño de 25 caballos, al tiempo que se examinaba el pelaje de los animales para determinar la posible presencia de huevos, y las heces para comprobar si había larvas 3. Las muestras de suero se enfrentaron a los productos de excreción/secreción de larvas 2 de G. intestinalis y de G. nasalis. Diferentes investigaciones han señalado que estas 2 especies son las de mayor prevalencia en équidos (Coles y Pearson, 2000; Lyon et.al., 2000; Otranto et al., 2005), por lo que la posibilidad de infestaciones mixtas en un mismo caballo es elevada. El punto de corte se calculó con sueros de caballos que al sacrificio no presentaban larvas de los parásitos, determinándose como la media de las absorbancias + 2 desviaciones estándar. El análisis de 398 sueros de caballos para estudiar la distribución de la seroprevalencia de esta miasis (segundo objetivo) mostró que el 50% era positivos. En invierno se detectaron los porcentajes más elevados de presencia de anticuerpos frente a Gasterophilus (100%) y los más bajos en junio-julio (3-9%). Se demostraron variaciones estacionales de la respuesta inmunitaria humoral, con una disminución de enero a julio, e incremento de agosto a enero. Estos resultados se asociaron con la migración de los estadios de Gasterophilus en los equinos, estableciéndose que desde principios de invierno a finales de verano tiene lugar una reducción del estímulo antigénico, que denota la presencia de larvas 3 (con menor inmunogenicidad) o incluso la ausencia de estadios larvarios. Esta hipótesis se corroboró con la observación de larvas 3 en las heces de los equinos entre marzo y mayo, y de huevos en el pelo de los caballos desde junio a septiembre. Una vez que las larvas 3 maduran, abandona el tracto gastrointestinal y son eliminadas en las heces, y una vez en el suelo pupan. El incremento de la respuesta anticuerpo de verano a invierno parece reflejar la existencia de un nuevo estímulo antigénico, señalando la ingestión de huevos que continen larvas 1 en su interior. Se ha demostrado que la oviposición se produce a temperaturas superiores a 15ºC, que favorecen el vuelo de las moscas adultas. Ante estas condiciones, parece razonable asumir que la pupación en la zona de estudio (clima oceánico) concluye a finales de la primavera, y las moscas vuelan durante el verano; esto explicaría el hallazho de huevos de Gasterophilus en el pelo de los caballos de junio a septiembre. Una vez en la boca, las larvas 1 se liberan de los huevos y en aproximadamente 1 mes mudan a L2, que se dirigen al estómago e intestino y se convierten en L3, permaneciendo inmóviles durante 8-10 meses. Las larvas 2 presentan mayor antigenicidad que las L3, probablemente porque se produce la liberación de productos que favorecen su migración, y que podría explicar el aumento de la respuesta anticuerpo de agosto a enero. Es importante tener en cuenta que las L3 cuentan con ganchos alrededor del aparato bucal y espinas, que pueden provocar hemorragias, gastritis crónica, ulceraciones¿ que estimularían la presentación de antígeno al sistema inmunitario. En base a los resultados obtenidos, se sugieren la aplicación de 2 tratamientos antiparasitarios, uno curativo en verano para eliminar las L1, y otro preventivo en otoño para suprimir las L2. Del análisis conjunto de los datos recabados se concluye que la aplicación del ELISA con antígenos de larvas 2 de Gasterophilus proporciona una herramienta muy útil para la identificación de caballos infestados. Asimismo, resulta muy útil para definir la cronobiología de esta miasis, y fijar los momentos más adecuados para la administración de tratamientos antiparasitarios. El conocimiento de la interacción parásito/hospedador es clave para implementar estrategias eficaces en la lucha frente a estos agentes patógenos. Los caballos en pastoreo presentan un riesgo importante de infección por ciatostominos debido a la posibilidad de ingerir larvas 3 de estos nematodos junto con el alimento. Una vez en el intestino delgado, las larvas penetran la mucosa y dan lugar la formación de un quiste fibroblástico mural, donde se transforman en larvas 4 (L4). Después de eclosionar, las L4 se dirigen al lumen intestinal, mudan a L5 y finalmente a formas adultas, que eliminan huevos con las heces, haciendo posible su detección. El periodo de prepatencia o de aparición de huevos en la materia fecal es superior a 12 semanas, de forma que la técnica copromicroscópica de flotación aportaría información acerca de un estado patente de la infección, en el que las alteraciones patológicas más severas ya han tenido lugar. Para intentar solucionar esta situación, se llevó a cabo una tercera actividad en la que se prepararon antígenos de excreción/secreción de una mezcla de L3 de ciatostominos (Cyathostomum y Poteriostomum). Posteriormente, se purificaron en un sistema de cromatografía líquida a baja presión (FPLC, Fast Protein Liquid Chromatography), resolviéndose 3 complejos proteicos de 51, 29, y 15 kDa (P1-P3). La evaluación de la utilidad potencial de estos antígenos se realizó con un ELISA y sueros de 2 grupos de caballos infectados de forma natural. Mediante la elaboración de las curvas ROC tras la comparación de los resultados obtenidos por flotación y ELISA, se estableció el punto de corte, 0¿485, 0¿4955 y 0¿481, respectivamente; de igual modo, se obtuvieron valores superiores a 0¿9 para el AUC (área bajo la curva); los porcentajes de sensibilidad y especificidad fueron mayores de 90%. Se comprobó que la respuesta IgG frente a los 3 picos antigénicos aumentaba de forma significativa 4 semanas antes de la aparición de los huevos de ciatostominos en heces. Además, se estableció una correlación entre el recuento de huevos y los valores de anticuerpos frente a P3. Un aspecto a destacar en la infección por ciatostominos es que el desenquistamiento de las L4 de la pared intestinal provoca la liberación de productos de excreción/secreción. Esta podría ser la explicación al incremento en los valores de anticuerpos detectados 4 semanas antes de la aparición de los huevos en las heces. Estos resultados señalan la utilidad de la purificación de antígenos de ciatostominos por cromatografía líquida, para la obtención de productos susceptibles de utilización en pruebas inmunoenzimáticas que hagan posible el diagnóstico precoz de infección en caballos. Esta información es particularmente interesante si se tiene en cuenta que las ciatostominosis equinas son la diana principal de los programas para el control parasitario en estos animales. Bajo la denominación de sarcocistosis equina se describen dos tipos de cuadros clínicos, uno caracterizado por el desarrollo de una enfermedad que se ajusta en todos sus términos a los de una sarcocistosis típica, con formación de quistes musculares, denominada sarcocistosis muscular, y otro caracterizado por el desarrollo de una enfermedad de naturaleza neurológica, sin formación de quistes musculares, denominada sarcocistosis nerviosa. Los parásitos del género Sarcocystis spp. (Subclase Coccidia) pueden infectar a un amplio rango de mamíferos. Se necesitan dos hospedadores para completar el ciclo biológico, el hospedador definitivo (un carnívoro, generalmente el perro) en el que se desarrolla la fase sexual y que elimina ooquistes, y un hospedador intermediario (por ejemplo los caballos) donde la fase asexual tiene lugar con la producción de quistes de taquizoítos y bradizoítos. Al igual que sucede en otras especies animales, los équidos actúan como hospedadores intermediarios de varias especies del protozoo Sarcocystis spp. La infección por Sarcocystis y la formación de quistes suele cursar de forma subclínica. Por esta razón, el examen de músculos en la necropsia de los caballos puede suponer una subestimación de la prevalencia real de esta parasitosis. En el cuarto ensayo se realizó una encuesta serológica en 138 caballos aparentemente sanos de Galicia; se aplicó la inmunoelectrotransferencia con antígenos obtenidos de merozoítos de S. neurona. La seroprevalencia de sarcocistosis fue superior a 80%, pese a que habría que contemplar la posibilidad de inmunidad cruzada con antígenos de otros coccidios (Toxoplasma gondii, Besnoitia spp.). El reconocimiento de 2 proteínas de 30 y 16 kDa parece abundar en la exposición de los caballos a especies de Sarcocystis diferentes de S. neurona. Con el propósito de participar en competiciones deportivas, o simplemente objeto de transacciones económicas, se incrementan las posibilidades de viajar y de transportar caballos entre diferentes países. El continente americano es el único lugar que alberga a la zarigüeya (Didelphis spp.), hospedador definitivo de S. neurona, aspecto que limita geográficamente su presencia. Sin embargo, se ha puesto de manifiesto la presencia de anticuerpos frente a S. neurona en caballos sanos y con signos clínicos neurológicos de Francia. De acuerdo a estos resultados, se analizó mediante ELISA la respuesta inmunitaria humoral de los caballos de Galicia frente a varias proteínas recombinantes de la superficie de S. neurona (rSnSAG2 y rSnSAG4/3), encontrándose que menos del 4% de las 138 muestras eran positivas. Profundizando en este sentido, se testaron 246 sueros más empleando rSnSAG2-ELISA, y la seroprevalencia no alcanzó el 3%. Es interesante remarcar la seropositividad de 1 de las muestras frente a S. neurona. Se trataba de una yegua de 7 años proveniente de Irlanda, que en principio no estuvo expuesta a S. neurona (no estuvo en el continente americano), aunque se ha sugerido la ingestión de comida contaminada originariamente en EEUU como causa probable. Cabría elucubrar con la posibilidad de que esta especie haya encontrado en Europa un hospedador definitivo diferente de la zarigüeya. La inmunoelectrotransferencia se ha empleado como prueba definitiva para el serodiagnóstico de S. neurona en varios animales, y se considera altamente específica. Se ha demostrado que las infecciones por S. fayeri y S. neurona en caballos pueden distinguirse mediante esta técnica, haciendo posible detectar la presencia de anticuerpos frente a S. neurona en suero, hecho confirmado mediante examen histológico y observación microscópica de los quistes de ambas especies, que presentan diferencias estructurales. El análisis colectivo de todos los datos recabados revela que en Galicia los caballos tienen un elevado riesgo de exposición a Sarcocystis spp. La aplicación de un ELISA con antígenos recombinantes hace posible diferenciar específicamente si ha habido exposición a S. neurona.