Microenxerto e recultivo do calo basal na micropropagación de material adulto de carballo e castiñeiro

Resumo

INTRODUCIÓN O carballo (Quercus robur L.) e o castiñeiro (Castanea sativa Mill.) son dúas especies de moita importancia en Galicia, tanto dende o punto de vista forestal, como froiteiro e medioambiental. A súa propagación vexetativa pode permitir o mantemento de xenotipos de alto valor, sendo útil para a mellora e a conservación de recursos xenéticos na especie. No entanto, ambas especies son difíciles de propagar vexetativamente, especialmente no estado adulto. A micropropagación por cultivo in vitro representa, polo menos en parte, unha alternativa para a produción de material clonal de carballo e castiñeiro fronte ás técnicas convencionais de multiplicación vexetativa. Tanto o carballo como o castiñeiro téñense multiplicado por cultivo in vitro a partir de nós e ápices (San José et al., 1985; Viéitez e Viéitez, 1983; Viéitez et al., 1994; Sánchez e Viéitiez, 1991), presentando o estado adulto, de forma xeral, baixas taxas de multiplicación e de enraizamento adventicio. No presente traballo estudouse a utilización do calo basal, que se forma na base dos explantos durante o ciclo de multiplicación, como un explanto adicional ós explantos convencionais (nós e ápices), que normalmente non se usa, para tratar de aumentar a taxa de multiplicación do sistema in vitro. Asemade, utilizouse o microenxerto en serie in vitro e in vivo de material adulto de carballo e castiñeiro sobre patróns xuvenís, como técnica de rexuvenecemento para intentar recuperar as capacidades morfoxenéticas perdidas ó longo da fase de maduración. MATERIAL E MÉTODOS Utilizáronse catro clons adultos de carballo e un clon `adolescente¿, así como plántulas como material xuvenil. En castiñeiro utilizáronse catro clons adultos, un clon xuvenil e plántulas. Nos ensaios de calo basal, unha vez que se chega ó final dun ciclo de multiplicación, os calos basais reutilizáronse como un novo explanto, repetindo o proceso durante subcultivos sucesivos ata que os calos perderon a capacidade de producir novos explantos nodais e apicais. En cada recultivo analizouse a taxa de multiplicación dos calos comparándoa coa dos explantos convencionais (nós e ápices). Para realizar os ensaios de microenxerto, realizáronse microenxertos en serie, in vivo e in vitro, do material adulto sobre patróns xuvenís ou de comportamento xuvenil. Unha vez que os microenxerto prenderon e deron lugar a un novo crecemento, analizáronse in vitro a taxa de multiplicación e a capacidade de enraizamento adventicio. RESULTADOS A utilización de explantos con calo basal permite, tanto en carballo como en castiñeiro, aumentar de forma notable a produción de microbrotes, a menor custo unitario por microbrote producido. Un explanto con calo basal pode recultivarse varias veces, dependendo do xenotipo e do estado ontoxenético da planta nai. Determinouse que nun sistema de multiplicación in vitro que inclúa o recultivo do calo basal, a taxa de multiplicación de dito sistema se estabiliza en torno ó quinto subcultivo. Os calos basais que non portan xemas axilares nunca produciron microbrotes, o que practicamente asegura a fidelidade clonal, pois a aparición de brotes adventicios aumentaría o risco de mutación somaclonal. Con respecto ós ensaios de microenxerto, a porcentaxe de prendemento dos microenxertos pode considerarse elevada, sendo máis alta en carballo cando se practicou microenxerto in vivo e en castiñeiro cando se fixo in vitro. O grao de lignificación de púa e patrón é importante no éxito dos microenxertos in vivo. É mellor traballar con patróns pouco lignificados e púas algo lignificadas. O grao de lignificación dos microbrotes procedentes do recultivo do calo basal é máis axeitado que o daqueles obtidos por subcultivo convencional. Aínda que o microenxerto in vivo é máis doado de realizar, o microenxerto in vitro permite acelerar o microenxerto en serie (especialmente en castiñeiro) e a obtención de explantos. En xeral, o reaillamento de explantos das púas nos microenxertos in vitro realízase ós 35-40 días da realización do microenxerto. A duración dos ciclos de microenxerto in vivo en carballo encóntrase arredor dos 40 días, prolongándose ata 60 días ou máis no caso do castiñeiro. O microenxerto in vitro permitiu aumentar temporalmente a taxa de multiplicación nun dos clons estudados (clon EPS de Castanea sativa) nos primeiros subcultivos. Neste mesmo clon, o microenxerto in vivo provoca tamén un aumento significativo da taxa de multiplicación, mais esta vez o aumento detéctase tras a fase de estabilización in vitro. O microenxerto in vivo provocou igualmente o aumento temporal da taxa de multiplicación no clon QRFa, tendendo a desaparecer este efecto despois de 18 subcultivos No resto dos clons, o microenxerto non tivo efecto sobre a taxa de multiplicación. O microenxerto en serie, tanto in vitro como in vivo, non tivo efecto sobre as porcentaxes de enraizamento in vitro. Hai certas experiencias que confirman a utilidade do microenxerto como técnica de rexuvenecemento, incluído na recuperación permanente da capacidade rizoxénica de material adulto (Huang et al., 1992a, 1992b), mentres que noutros casos o efecto é transitorio (Padilla e Encina, 2001). Isto fai pensar que a maduración pode ser máis estable nunhas especies que noutras, encontrándose o carballo e o castiñeiro entres as que presentan unha maior resistencia á reversión do cambio de fase. Outros factores que poden ter influído na ineficacia do microenxerto poden ser: nalgún caso un número insuficiente de microenxertos en serie, a non miniaturización da púa, o cal parece ser un aspecto de bastante relevancia (Monteuuis, 2011), ou a proximidade da púa ó patrón (Danthu et al., 2002). Aínda que o microenxerto non permitise conseguir o efecto desexado, o microenxerto in vivo en serie pode ser considerado unha ferramenta útil para a obtención de planta enxertada en grandes cantidades, e como excelente alternativa ao forzado de segmentos de rama para a obtención de explantos para cultivo in vitro. BIBLIOGRAFÍA DANTHU P, HANE B, SAGNA P e GASSAMA YK (2002). Restoration of rooting competence in mature Faidherbia albida, a Sahelian leguminous tree, through serial root sucker micrografting. New Forests, 24: 239-244. HUANG LC, HSIAO CK, LEE SH, HUANG BL e MURASHIGE T (1992a). Restoration of vigor rooting competence in stem tissues of mature Citrus by repeated grafting of their shoot apices onto freshly germinated seedlings in vitro. In vitro Cell. Dev. Biol., 28: 30-32. HUANG LC, LIUS S, HUANG BL, MURASHIGE T, MAHDI EFM e VAN GUNDY R (1992b). Rejuvenation of Sequoia sempervirens by repeated grafting of shoot tips onto juvenile rootstocks in vitro. Plant Physiol. 98: 166-173.