Prevalencia de virus entéricos en moluscos cultivados en Galiciaestudio de la fiabilidad de microorganismos indicadores de contaminación viral

Resumo

En el medio acuático, se puede encontrar una gran variedad de especies de virus infecciosos para el ser humano, denominados virus entéricos que normalmente se transmiten vía fecal-oral. Tras su vertido al medio, estos virus pueden sobrevivir durante semanas o meses en la columna de agua o asociados a la materia particulada, acumulándose en los sedimentos. Una consecuencia de este hecho, es que los moluscos obtenidos de zonas polucionadas, pueden estar contaminados con virus entéricos, constituyendo un riesgo potencial para la salud del consumidor. La detección de virus entéricos a partir de tejidos de moluscos, debido a la baja concentración en que en ellos aparecen las partículas virales, implica la extracción y concentración viral y la amplificación del ácido nucleico mediante RT-PCR. Se hace así necesario, la elección de unos métodos de extracción y amplificación que presenten una alta especificidad y sensibilidad. La utilización de kits comerciales favorecería la estandarización necesaria de los métodos de detección de estos virus, entre los laboratorios a nivel mundial. Los resultados obtenidos con los kits de RT-PCR evaluados en este estudio mostraron diferencias en la amplificación del RNA de HAV. La mayor sensibilidad (0,2-1 ufp/µl) se obtuvo con el kit SuperscriptTM One-Step RT-PCR System (lo que se correspondería aproximadamente con 10-50 partículas físicas por microlitro). Este límte de sensibilidad fue entre 10 y 250 veces mayor que con el procedimiento normalmente empleado en nuestro laboratorio y con el kit Ready-to-GoTM RT-PCR Beads y de entre unas 100 a 2500 veces con otros kits evaluados. Con resepcto a los kits comerciales de extracción de RNA, los resultados mostraron que tanto el Total Quick RNA Cells & Tissues (en sus dos versiones mini y maxi) (Talent), como el RNeasy® Plant Mini Kit y RNeasy® Maxi Kit, presentaron mejores eficacias de extracción que el protocolo habitual usado de rutina en el laboratorio, siendo el Total Quick RNA Cells & Tissues versión mini el más efectivo con un límite de detección de 0,1-1 ufp/mg de tejido digestivo de mejillón (equivalente a 5-50 partículas físicas por miligramo). La adecuada selección de los cebadores es otro de los pasos más importantes para lograr una sensibilidad y la especificidad adecuadas, particularmente en casos en los que existe heterogeneidad entre las cepas virales. De las parejas de cebadores evaluadas para la detección de HAV, la pareja que mostró la mayor sensibilidad fue la HAV240/HAV68 con un rango entre 0,02 y 1 ufp/µl o g de hepatopáncreas siendo ésta un logaritmo más sensible que la obtenida con la pareja de cebadores HAVp3 y HAVp4. En cuanto a la detección de AsV, la mejor sensibilidad se encontró con la pareja de cebadores A1/A2 (0,1-1 ufp/µl o g de hepatopáncreas), mostrándo una diferencia en sensibilidad mayor de 3 logaritmos en relación con la pareja AV15/AV12. En base a estos resultados se seleccionaron para el empleo en la detección de virus entéricos en nuestro laboratorio los kits comerciales Total Quick RNA Cells & Tissues versión mini para la extracción de RNA a partir de muestras de tejido digestivo de moluscos y el kit SuperscriptTM One-Step RT-PCR System para la retrotranscripción y amplificación del RNA viral, así como la pareja de cebadores HAV240/HAV68 para la detección de HAV y A1/A2 para la detección de AsV. La Unión Europea, establece una serie de controles para los moluscos destinados a consumo humano y sus áreas de producción que están basados en indicadores bacterianos de contaminación fecal, específicamente E. coli. Según estos controles, los moluscos que presenten más de 230 E. coli por cada 100 g de carne de molusco y líquido intervalvar, deben sufrir procesos de depuración, reubicación en aguas limpias o tratamientos por calor antes de ser destinados a consumo humano. Sin embargo, muchos estudios demuestran que los controles actuales no garantizan que las muestras que cumplen los criterios establecidos, estén libres de contaminación viral. Entre los indicadores alternativos propuestos, los bacteriófagos RNA F+ fueron los que acapararon una mayor atención ya que comparten muchas propiedades físicas y genómicas con los virus entéricos de interés. Para determinar la prevalencia de los virus entéricos en moluscos, se realizó un estudio de la contaminación viral (HAV y AsV) que presentaban diversas especies de moluscos bivalvos, tanto cultivados como silvestres, procedentes de la Ría de Vigo durante un período de 3 años mediante técnicas convencionales de RT-PCR y RT-PCR a tiempo real (rRT-PCR). Además, en un conjunto de muestras pertenecientes al año 2005 se amplió la detección a un mayor número de especies virales. Así mismo, y con el fin de establecer la validez de los indicadores, se determinaron las cantidades de E. coli y bacteriófagos RNA F+ presentes en las muestras. Los resultados mostraron que del total de las muestras, prácticamente la mitad presentó contaminación por alguno de los virus estudiados, detectándose coexistencia de ambos virus en una misma muestra. Por otro lado, se observó una mayor contaminación en las muestras silvestres (57,6%) que en las cultivadas (54,4%). La mayor contaminación de las muestras silvestres está probablemente relacionada con la situación de los puntos de muestreo en la costa, donde la influencia de la contaminación antropogénica es mayor. HAV fue el virus que presentó una mayor prevalencia, encontrándose en el 44,3% de las muestras estudiadas. En las muestras en las que se amplió el número de especies virales analizados, pertenecientes al año 2005, se observó que el porcentaje de muestras contaminadas por, al menos uno de los virus de estudio, ascendió hasta el 63,4% encontrándose una mayor contaminación, al igual que en el caso anterior, en las muestras silvestres. El virus que se detectó en un mayor número de estas muestras fue el genogrupo II de NoV, que presentó un claro patrón estacional no encontrándose en los meses cálidos del año, seguido de EV, AsV, NoV GI y RV, y no detectándose en ninguna de ellas ni HAV ni AiV. En relación con la determinación de los niveles del indicador establecido por la legislación, E. coli, y con los bacteriófagos RNA F+, no se encontró una correlación estadísticamente significativa entre los recuentos de indicadores con la presencia viral en las muestras. Por otro lado, se realizó un estudio para ver la potencialidad de los bacteriófagos RNA F+ como indicadores de contaminación viral en muestras de moluscos durante distintos tipos de depuración comercial. Los resultados de este estudio mostraron la pobre eliminación viral durante los procesos de depuración, encontrándose los mismos porcentajes de detección de HAV y NoV antes y después de la depuración (7,6% y 1,5% respectivamente). Los resultados de los bacteriófagos RNA F+ demostraron, no sólo la pobre eliminación de este posible indicador viral durante el proceso depurativo (sólo un 63,6% de los casos estudiados cumplirían los criterios propuestos), sino una ausencia de correlación entre los valores de contaminación detectados en función de E. coli o estos bacteriófagos, con la presencia de virus. Así, los resultados de nuestro estudio demostraron que la depuración no asegura la eliminación de virus entéricos en moluscos contaminados y que el cumplimiento de los niveles de E. coli establecidos por ley no garantiza la ausencia de virus en los moluscos destinados a consumo humano. En las últimas décadas, en España se ha incrementado el volumen de importaciones realizadas desde países en desarrollo. Este incremento en las importaciones de moluscos conlleva un problema sanitario asociado, ya que muchas de las áreas geográficas origen de las importaciones son endémicas para enfermedades provocadas por virus entéricos. Para evitar las infecciones virales transmitidas por moluscos contaminados, todas las importaciones han de pasar los mismos controles que las muestras de origen europeo, basados en el recuento de E. coli que, como ya se ha mencionado, no garantizan la ausencia de virus. Se realizó un estudio de detección de virus entéricos en muestras de moluscos importados desde estas áreas geográficas. Los resultados mostraron que en más de la mitad de las muestras (51,6%) se encontró alguno de los virus analizados. El virus que mostró una mayor prevalencia fue NoV GI (32,3%), seguido de AsV (22,6%), NoV GII (9,7%) y HAV (6,4%). Los resultados de estos estudios indican la necesidad de una metodología específica y estandarizada, así como de estudios sistemáticos de moluscos y sus áreas de producción, con el fin de evaluar la magnitud real de la contaminación viral en el medio y su relación con la epidemiología de las enfermedades entéricas de origen viral. Además, se pone de manifiesto que el método más apropiado para determinar la contaminación vírica es por medio de la detección viral directa, y que el empleo de indicadores, sea cual sea la naturaleza de los mismos, es poco fiable. Por último, los resultados pusieron también de manifiesto la necesidad de un mejor control microbiológico de los moluscos destinados a consumo humano, especialmente de los importados desde áreas donde enfermedades como la gastroenteritis vírica y la hepatitis son endémicas.