Purificación y caracterización de una isoforma calcio dependiente de proteína quinasa c en mytilus galloprovincialis lmk

Resumo

INTRODUCCIÓN Las Quinasas Las quinasas son enzimas fosforilantes que catalizan la adición de un grupo fosfato procedente de ATP u otro nucleósido trifosfato al grupo hidroxilo de un aminoácido de la proteína sustrato, generando la formación de un enlace fosfoéster. Pueden actuar sobre glúcidos, lípidos o proteínas. Si actúan sobre proteínas podemos distinguir dos tipos de proteínas quinasas: PKs de serina - treonina que fosforilan residuos serinas o treoninas (como la PKA o la PKC), y PKs de tirosina que actúan sobre residuos tirosina como la familia de las Src quinasas. Proteína quinasa C Existen numerosas referencias en la bibliografía otorgando a esta proteína un papel central en la transducción de señales en la célula. Así, se ha implicado a la PKC en la regulación del crecimiento y diferenciación celular, desarrollo neural, transmisión sináptica, regeneración axonal, contracción y relajación del músculo liso, secreción endocrina y exocrina, desarrollo de tumores, apoptosis y envejecimiento. Se pensaba que la PKC residía en el citoplasma en una conformación inactiva y que se translocaba a la membrana plasmática o a los orgánulos citoplasmáticos debido a la activación celular por diferentes estímulos. Sin embargo, las evidencias recogidas durante los últimos 20 años han mostrado que la PKC es capaz de translocarse al núcleo. Se han descrito hasta el momento once isotipos de PKC diferentes, cada isotipo tiene un rol distinto. Las PKCs pueden clasificarse en tres grandes grupos: A) Las clásicas o dependientes de calcio (cPKCs): ¿, ßI, ßII y ¿. Son sensibles al Ca2+, DAG y son activadas por ésteres de forbol, clásicamente forbol 12 - miristato 13 - acetato (PMA) y fosfatidilserina (PS). B) Las nuevas o independientes de calcio (nPKCs): ¿, ¿, ¿ y ¿. Son independientes de Ca2+ (carecen de región C2) pero son activadas por ésteres de forbol, fosfatidil serina y diacilglicerol. C) Las atípicas, (aPKCs): ¿, ¿, ¿. Estas son independientes de Ca2+ (carecen de la región C2) y no son sensibles a los ésteres de forbol, DAG y PMA, son dependientes de PS y estos isotipos tienen tan solo una secuencia rica en cisteina en la región C1. Adicionalmente, PKC ¿ y ¿ son considerados por algunos una cuarta clase y para otros comprenden una familia distinta llamada proteína quinasa D. Todos los miembros tienen en común un dominio catalítico conservado en la región carboxilo terminal. La otra mitad de la quinasa, el dominio regulador presenta 2 partes clave: una secuencia autoinhibidora (pseudo-sustrato) y uno o dos módulos de unión a la membrana (dominios C1 y C2) y, en el caso de la proteína quinasa D, el dominio PH. Estructura de las PKCs Todas las isoformas de PKC están formadas por una cadena polipeptídica, en la que se detectan regiones conservadas (C1-C4) separadas por regiones variables (V1-V5). La región carboxilo-terminal que comprende las regiones C3-V5, ha sido definida como el dominio catalítico, el cual está separado del dominio regulador amino-terminal por la región V3. El dominio catalítico contiene secuencias consenso para la unión de ATP (región C3), la región de transferencia del fosfato y el sitio de unión del sustrato (región C4). El dominio regulador contiene varias regiones que permiten la interacción de la proteína con lípidos y los cofactores necesarios para su activación. La región V1 contiene una secuencia considerada como un pseudosustrato que es muy similar a secuencias de fosforilación para PKCs, excepto porque el residuo diana de serina/treonina está sustituido por un aminoácido no fosforilable, generalmente alanina. Distribución tisular de la PKC Se ha determinado mediante análisis por Northern o Western blot la distribución de las isoenzimas PKC (esta distribución aparece resumida en la Tabla 1.1). Las PKC ¿, ßI, ßII, ¿, ¿ y ¿ parecen ser isoenzimas ubicuas que aparecen en la mayoría de los tejidos, mientras que la expresión de otras PKCs es en gran parte específica del tipo de célula. Los tejidos están constituidos por distintos tipos celulares, por tanto, es importante determinar qué isoenzimas están presentes en cada uno de ellos. De igual forma, es interesante establecer el perfil de las isoformas en los cultivos celulares, puesto que pueden existir diferencias entre las células cultivadas y el tipo celular de procedencia. En general, las diferentes isoformas de PKC tienen patrones de distribución específicos en la célula, que reflejan los diferentes papeles de cada isoforma. Distribución subcelular de la PKC Las formas inactivas de la PKC se encuentran mayoritariamente en el citosol, mientras que sus activadores, de naturaleza hidrofóbica, están presentes en la membrana. Recientemente, se han realizado estudios con técnicas de microscopía confocal, que revelan una localización más compleja y específica de las diferentes isoenzimas de la PKC. Estos estudios demuestran que en células que expresan varias isoformas, la mayoría de ellas se encuentran localizadas en estructuras subcelulares y, tras la activación, mudan su localización a diferentes localizaciones en la célula. Las isoformas de PKC ¿, ß y ¿ se localizan principalmente en la fracción citosólica de células no estimuladas y experimentan una translocación a las membranas celulares de células activadas. Activación de PKC Para las cPKCs, el modelo de activación intracelular, aceptado actualmente, sería el siguiente: 1) La activación de la PLC gamma produciría la hidrólisis de fosfatidilinositol 4,5 - bifosfato (PIP2), asociado a la membrana, liberándose DAG e IP3. 2) El IP3 producido provocaría la liberación de calcio de reservas intracelulares no mitocondriales. 3) El calcio liberado se uniría a la región C2 de la PKC produciendo la translocación de la enzima a la membrana plasmática. 4) Una vez en la membrana plasmática, la PKC se uniría a través de la región C1 al DAG, generado anteriormente y a PS, que está constitutivamente presente en la membrana, produciéndose su activación. Translocación Una particularidad importante en la activación de PKC es la redistribución intracelular de la enzima. La PKC ha sido localizada en la fracción citosólica de las células y la activación de esta quinasa está asociada a una redistribución de la enzima desde el citosol hacia ambientes más hidrofóbicos como puede ser la membrana plasmática. La unión de Ca2+ y DAG a esta quinasa en presencia de fosfatidil L-serina (PS), provoca un cambio conformacional en la PKC, incrementándose de esta forma, su hidrofobicidad. La dinámica del movimiento de la quinasa a la membrana plasmática, en respuesta a la activación de receptores de superficie celular, ocurre en tres pasos: la translocación a la membrana, el anclaje y la disociación. Se sabe que estos procesos son regulados por autofosforilaciones, aunque la quinasa se fosforile en el citosol, necesita de varias fosforilaciones para alcanzar la membrana, aún en presencia de calcio. Las fosforilaciones inciden en el aumento de la afinidad por DAG y PS. Finalmente, una vez cesada la estimulación sobre el receptor de superficie, se produce la disociación de la PKC, por un descenso de los niveles de DAG y Ca2+, que inducen una autofosforilación de los dominios reguladores. Proteolisis de PKC La PKC fue descubierta como una proteína quinasa activada por proteasas, aunque posteriormente se vio que la proteolisis seguía a la activación. Se piensa que las proteasas responsables, "in vivo", son las proteasas neutras dependientes de calcio (calpainas I y II). La activación proteolítica se puede realizar "in vitro" mediante tratamiento limitado con tripsina aunque "in vivo" se piensa que la activación y translocación a la membrana celular son requisitos previos a la proteolisis. No está claro si la degradación proteolítica sirve como mecanismo para inactivar la quinasa o si el fragmento catalítico liberado de la membrana o del citosol (y posiblemente de otros compartimentos celulares), es capaz de actuar como una quinasa con actividad constitutiva independiente de activadores. Down regulation Otro mecanismo importante dentro de los procesos de regulación es la "down regulation". Se denomina "down regulation" al fenómeno por el que se depleciona la PKC, por degradación proteolítica, como consecuencia por ejemplo del tratamiento prolongado de determinados tipos celulares con ésteres de forbol. Con respecto a la "down regulation", las distintas isoenzimas de PKC muestran rasgos muy diferentes que están de acuerdo con los observados in vitro. Regulación de la PKC La proteína quinasa C es regulada por dos mecanismos secuenciales e igualmente críticos: fosforilación provocada por la PDK-1, y unión a DAG y/o otros cofactores. Cada mecanismo regula la estructura, localización subcelular y función de la PKC. Las PKCs recién sintetizadas se asocian a un compartimento de membrana en la célula y en una conformación "abierta" en la que la secuencia auto-inhibitoria del pseudo-sustrato es expulsada del sitio activo del dominio catalítico. La PDK-1 se acopla al C-terminal expuesto y el sitio de la PDK-1 en la secuencia del asa de activación queda accesible para su fosforilación. Tras la fosforilación de la secuencia del asa de activación, PDK-1 es liberada del C-terminal de la PKC, y éste queda expuesto para sufrir dos fosforilaciones rápidas. En el caso de PKCs convencionales, esta fosforilación ocurre por un mecanismo intramolecular de auto-fosforilación. Las especies fosforiladas (maduras) son liberadas al citosol y el pseudosustrato puede acceder al sitio activo, manteniendo la enzima en un estado autoinhibido. La enzima es activada tras la generación de calcio y diacilglicerol mediada por receptores. Estos ligandos reclutan la PKC de la membrana mediante la participación de dos módulos de anclaje en la membrana, un suceso que proporciona la energía necesaria para expulsar al pseudosustrato de la cavidad de unión del sustrato y permite la fosforilación del sustrato. Proteínas de anclaje de las PKC Las proteínas que interactúan con isoformas específicas de PKC para la localización en los compartimentos especializados de la célula son llamadas proteínas de anclaje (o de corte). Las proteínas de anclaje para las isoenzimas de la PKC activas se han denominado como receptores para quinasa C activas (RACK). RACK1, que fue la primera proteína de anclaje en ser aislada para PKC ßII reveló la unión de varias isoformas de PKC inclusive PKC ¿ y PKC ¿. Mochly-Rosen y Gordon (1998) han propuesto la existencia de otro grupo de proteínas de anclaje para las formas inactivas de la PKC que han sido denominadas receptores para quinasa C inactivas (RICK). RICKs Se han identificado proteínas adicionales de unión a la PKC, todas ellas son sustrato de la PKC y unen directamente PS. La unión de PS es común en este tipo de proteínas de unión, la cual parece actuar de puente entre la PKC y dichas proteínas. Entre éstas se incluyen la talina, la vinculina, sustrato de la quinasa C rico en alanina miristoilada (MARCK), AKAP79, y algunas otras. Entre algunas de las características predichas para estas RICK se encuentran las siguientes: no necesariamente son sustratos de la PKC, deben demostrar preferencia de unión por formas inactivas de este enzima y, finalmente, los ésteres de forbol u otros activadores de la PKC deben inducir la separación del complejo RICK/PKC. RACKs Estas proteínas están presentes en la fracción celular particulada y unen la quinasa C activa de forma selectiva y saturable. En estos casos, un puente de PS parece no ser suficiente para establecer la unión, sino que se requieren interacciones proteína-proteína directas. Otra propiedad de esta interacción es que la unión de la PKC al RACK no está inhibida por péptidos sustrato, indicando que el anclaje no se produce en el lugar catalítico o lugares de fosforilación de la PKC. Sustratos de PKC Sustratos de PKC "in vitro" Durante cierto tiempo se observó que, al menos, "in vitro" las cPKCs eran serina / treonina quinasas no específicas. Por tanto, cualquier proteína básica, como histona HI, HIIIS, proteína básica de mielina (MBP), protamina u otros péptidos podrían utilizarse como sustratos, siempre y cuando tuvieran la secuencia XRXXS/TXRX; siendo este rasgo muy distinto de la especificad de sustrato que presentaban muchas de las quinasas estudiadas hasta entonces. Sin embargo, una comparación de las isoenzimas de PKC y sus actividades hacia distintos sustratos, "in vitro", ha mostrado diferencias que pueden indicar una cierta especificad hacia los sustratos naturales bajo condiciones fisiológicas. Sustratos de PKC "in vivo" En cuanto a los sustratos de PKC in vivo resaltar que: Mediante el marcaje de células con 32P y estimulación de las mismas con ésteres de forbol u otros agonistas que estimulan la PKC, se han descubierto muchos posibles sustratos fisiológicos. Hay tres sustratos importantes en el control de la proliferación celular: a) MARKS su fosforilación lleva a una redistribución de los filamentos de actina desde la membrana al citoplasma; b) y c) DNA topoisomerasa y lamina B, que son proteínas nucleares implicadas en el control de la síntesis de DNA, y que darían relevancia a la translocación de la PKC al núcleo. Las proteínas MARCKS (sustratos de la quinasa C ricos en alanina miristoilada) y proteínas relacionadas con MARCKS (MRP) están distribuidas extensamente como proteínas unidas a las membranas, son los principales sustratos de las PKCs y están implicadas en la propagación de las células, la activación de la integrina y la exocitosis. MARCKS, se une a la F-actina y puede funcionar como un puente cruzado entre la actina del citoesqueleto y la membrana plasmática. Su importancia es debida al hallazgo de que MARCKS están implicadas directamente en la hipersecreción de mucus que ocurre durante enfermedades tales como el asma, y la bronquitis o fibrosis cística crónicas. INHIBIDORES DE PKC Se denomina inhibidor a toda sustancia que se une a una enzima y reduce la velocidad de la reacción que cataliza. La inhibición de algunas enzimas por inhibidores específicos constituye un importante sistema de regulación de las reacciones que ocurren en las células y en ciertos casos tiene aplicaciones clínicas. Podemos clasificar los inhibidores en dos tipos: Inhibidores Irreversibles Inhibidores Irreversibles (Inhibidores Competitivos, Inhibidores no Competitivos). Según el mecanismo de acción de los inhibidores también podemos clasificarlos en: a) Inhibidores de la unión de ATP (Ej: bisindolilmaleimidas e indolcarbazoles, son derivados de la estaurosporina). b) Inhibidores que actúan en la región C1 afectando a la unión de ésteres de forbol / DAG (Ej: Calfostina C, Gossipol, etc). c) Inhibidores de la interacción PKC-fosfolípido (Ej: Curcumina, Propanolol, Dibucaina, etc). d) Proteínas que inhiben la PKC (Ej: KCIP, Calciproteínas, etc). e) Agentes disruptivos de membrana (Ej: Etanol, Tocoferoles, etc). f) Inhibidores químicos y otras drogas [Ej: Antralina, Pb2+, Complejos de Pt (II), etc]. PKC en eucariotas inferiores Además de en mamíferos, PKC o proteínas relacionadas con la PKC se han encontrado en eucariotas inferiores tales como levaduras en otros organismos como Drosophila, Caenorhabditis elegans; Dictyostelium y oocitos de Xenopus laevis. En Saccharomyces cerevisiae se han encontrado tres isoformas similares a las PKCs del grupo de las clásicas; estas isoformas fueron activadas por Ca2+, PS y DAG o PMA, utilizando la histona III-S como sustrato. Por el contrario, Ogita y sus colaboradores (1990) aislaron una PKC a partir de S. cerevisiae, que fue activada por Ca2+, PS y DAG, pero no por PMA. En Drosophila se han encontrado tres isoformas de la PKC, dos son similares a las PKCs clásicas de mamíferos y la tercera es homóloga a la PKC ¿. 1.8.1. PKC en moluscos En moluscos, por clonaje molecular Kruger y sus colaboradores (1991) obtuvieron evidencias acerca de la existencia de dos isoformas de PKC en el molusco marino Aplysia californica, Apl I y Apl II, las cuales se expresan abundantemente en el sistema nervioso. En las neuronas de Aplysia, la activación de la PKC está implicada en la modulación neuronal, que incluye la facilitación presináptica entre las neuronas sensoriales y las motoras; un proceso celular que está implicado en la sensibilización o deshabituación. La quinasa Apl I es fuertemente activada por los ácidos grasos de configuración cis, pero sólo en presencia de Ca2+. Además, funcionalmente Apl I es más parecida a las isoformas ¿ y ß de vertebrados que a la isoforma ¿ neural de vertebrados. La quinasa Apl II es Ca2+ independiente y se parece a la PKC ¿ de vertebrados. PKC y PKA en M. galloprovincialis En cuanto al mejillón, Nuestro grupo de trabajo ha abordado como objetivo durante los ultimos años el estudio de las proteínas quinasas en este molusco. Así se ha purificado una proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) de manto de M. galloprovincialis que se ha visto involucrada en la fosforilación de la fosfofructoquinasa-1 (PFK-1) de manto de la misma especie. Además se ha podido correlacionar los índices de actividad quinasa con los niveles de AMPc, en el mismo tejido. Por otra parte en M. galloprovincialis (Lmk) han sido identificadas en manto, branquias y pie, 3 isoformas de PKC, que fueron reconocidas como PKC ¿, PKC ß y PKC ¿, mediante la utilización de anticuerpos contra las respectivas isoenzimas de mamífero. Más recientemente nuestro grupo de trabajo ha purificado y caracterizado bioquímicamente una nPKC en el manto de mejillón con un peso molecular de 105 kDa, la cual se ha denominado como p105, presenta actividad quinasa dependiente de fosfatidil L-serina y PMA e independiente de Ca2+. Se comprobó que la p105, estaba presente en manto, branquias, pie, músculo aductor posterior, hepatopráncreas y hemocitos de M. galloprovincialis. "In vitro", la proteína p105 es capaz de autofosforilarse sin la presencia de cofactores lipídicos, los parámetros cinéticos de esta proteína, la asemejan a una isoforma nPKC de mamíferos. El modelo experimental: Mytilus galloprovincialis Lmk Los mejillones del género Mytilus se localizan en aguas litorales y sublitorales poco profundas, tanto en litoral abierto como en estuarios de aguas salobres. Preferentemente se asientan en lugares de aguas movidas y viven de forma sésil adheridos por medio del biso a sustratos resistentes, como rocas, guijarros y arenas de mar compactas. El tipo de vida, así como su localización litoral lo exponen a las condiciones típicas de la vida intermareal, en la cual uno de los principales condicionantes es la exposición periódica al aire durante la marea baja. El límite superior de supervivencia de esta zona viene impuesto por la duración del período de exposición al aire y por el grado de humedad disponible durante ese tiempo. Los moluscos bivalvos son animales protóstomos celomados, con simetría bilateral y no segmentados. Presentan una concha que se encuentra formada por dos valvas iguales, unidas dorsalmente y entre las cuales se dispone el cuerpo y la cavidad paleal. La musculatura se encuentra adherida a la concha y son los músculos aductores, anterior (MAA) y posterior (MAP), los más destacados. En la cavidad paleal sobresalen las branquias, que además de actuar como órgano respiratorio, colaboran en la alimentación. El aparato digestivo de Mytilus consta de boca (rodeada de palpos labiales), esófago estomago e intestino. Rodeando al estómago y parte del intestino se localiza la glándula digestiva o hepatopáncreas. El manto es el principal tejido de reserva del molusco y permanece adherido a la concha por unas fibras musculares que constituyen la línea o seno paleal. El pie es un órgano musculoso, con forma de hoja y comprimido lateralmente, cuyos movimientos se consiguen por una combinación de acciones musculares y de presión hidráulica. Inmunidad: sistemas y respuestas inmunitarias El sistema inmune en todos los animales comprende elementos celulares y humorales que interaccionan para proteger al organismo de patógenos, parásitos y células neoplásicas, de forma que todos los organismos manifiestan una capacidad determinada genéticamente para distinguir entre lo propio y lo extraño. Los organismos multicelulares poco evolucionados sólo presentan un tipo de inmunidad, denominada innata que es exclusivamente celular y filogenéticamente más antigua que la inmunidad adquirida, que está presente en organismos como peces (cartilaginosos y óseos), anfibios, reptiles, aves y mamíferos. Células y tejidos del sistema inmune en invertebrados En el sistema circulatorio de invertebrados, se detecta una gran variedad de tipos de células sanguíneas, las cuales, aparentemente, desempeñan funciones variadas como son transporte, almacenamiento, reparación de heridas y pigmentación, así como defensa del organismo. Las respuestas celulares son realizadas por hemocitos, los cuales poseen la capacidad de fagocitar patógenos y desarrollar el proceso de encapsulación de metazoos. Poblaciones celulares en hemolinfa de moluscos bivalvos Existen diferentes opiniones en relación al número y tipo de hemocitos en moluscos bivalvos, así como en su clasificación celular. La existencia de diversos tipos de clasificación se debe a la variabilidad de técnicas empleadas, que abarcan desde las morfológicas hasta la citrometría de flujo. En la hemolinfa de M. galloprovincialis han sido detectados dos tipos diferentes de células. En primer lugar, un grupo de células pequeñas redondeadas, denominadas células RH, con un núcleo que ocupa casi la totalidad de la célula y un pequeño volumen de citoplasma, que a veces es tan sólo un halo alrededor del núcleo. El segundo tipo celular encontrado en hemolinfa de M. galloprovincialis, presenta un mayor tamaño y un citoplasma expandido, son las células SH. El lipopolisacárido bacteriano (LPS) y las citoquinas en la respuesta inmune La respuesta inmune está regulada por múltiples y complejas interacciones entre moléculas, las cuales desencadenan señales de transducción intercelulares. Algunas de estas moléculas importantes en la respuesta inmunitaria son el lipopolisacárido bacteriano y las citoquinas.El lipopolisacárido o LPS es el principal componente de la membrana externa de bacterias Gram-negativas y posee la capacidad para activar macrófagos de vertebrados y hemocitos de invertebrados. OBJETIVOS En el presente trabajo se propone como objetivo global, el estudio en manto de mejillón M. galloprovincialis de alguna isoforma de las cPKCs descritas en otros organismos. Este objetivo general puede dividirse en varios subobjetivos: 1) Determinar la presencia de actividad cPKC en el manto del mejillón Mytilus galloprovincialis Lmk. 2) Purificar y caracterizar bioquímicamente dicha isoforma de cPKC. 3) Estudiar la distribución tisular de la isoforma cPKC purificada del mejillón M. galloprovincialis Lmk. y determinar su ubicación predominante en las fracciones citosólica y de membrana. 4) Obtener anticuerpos policlonales específicos contra la isoforma cPKC purificada, como herramienta para el estudio de la enzima. 5) Determinar la presencia de la isoforma cPKC purificada en los hemocitos del mejillón y estudiar el efecto de diferentes inductores (IL-2, PDGF y LPS) sobre la expresión de esta cPKC en los hemocitos de M. galloprovincialis Lmk. 6) Realizar un estudio comparativo de los resultados obtenidos para la forma dependiente de calcio (cPKC) y los obtenidos para la forma independiente de calcio (p105). Para alcanzar este objetivo previamente es necesario completar los siguientes pasos. 6.1. Purificar la isoforma nPKC (p105). 6.2. Completar el estudio cinético realizado por Mercado, (2001), para la enzima p105 utilizando otros péptidos sustratos. 6.3. Estudiar el efecto producido por diferentes inductores (IL-2, PDGF y LPS) sobre la expresión de p105 en hemocitos de M. galloprovincialis Lmk. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Nuestra investigación se centró en el diseño de un método eficaz para la purificación de una proteína tipo cPKC de manto de mejillón y comparar los resultados obtenidos para esta con los resultados previos obtenidos por Mercado y colaboradores. Al ser las PKCs enzimas translocables se pueden encontrar tanto asociadas a la fracción citosolica como a la membrana plasmática. Aunque algunos autores han utilizado, preferentemente la fracción de membrana para la purificación de nPKCs tanto en vertebrados como en invertebrados, su purificación puede ser más eficiente a partir de la fracción citosolica, tal como han demostrado en este laboratorio Mercado y colaboradores. La purificación de la enzima p60 se hizo a partir del manto de M. galloprovincialis, que había mostrado una elevada actividad cPKC en el estudio preliminar. El primer paso cromatográfico es común a otras purificaciones de cPKCs y nPKCs. Las isoformas de cPKCs de vertebrados se eluyen de DEAE Sepharose con una baja fuerza iónica. En higado de rata se obtiene un pico de actividad PKC cuando la concentración de NaCl es aproximadamente 100 mM. Las proteínas con actividad cPKC y nPKC que hemos purificado a partir de manto de M. galloprovincialis, requieren en ambos casos de una fuerza iónica menor para su elución, NaCl 25 mM. La cromatografía de gel filtración en la columna Superdex 200 HR 10/30 permitió purificar a homogeneidad la cPKC de 60 kDa que denominamos como p60 y también se puede observar como la otra proteína de 105 kDa que denominamos como p105 se va separando de p60 a medida que progresa la cromatografía pasando a tener la p60 totalmente pura en el 2º pico del cromatograma. La cromatografía de adsorción sobre HTP, suele ser la que mejor determina la eliminación de contaminantes. En nuestro caso ha permitido obtener la enzima p105 pura, cuando se eluye con fosfato de potasio 300 mM. En la purificación de isoformas de PKC en el molusco Aplysia, también se utiliza la cromatografía sobre HTP como último paso de purificación, obteniéndose dos picos de actividad PKC, uno cuando el fosfato de potasio alcanza una concentración de 180 mM, y otro se recoge con una concentración de 400 mM. Este segundo pico es coincidente con el que se obtiene con la enzima p105 de mejillón. La purificación por métodos convencionales de isoformas de PKC de invertebrados no es un tema profundamente estudiado. Es el caso del camarón Penaeus monodon, de cuyo hepatopáncreas se purificaron tres isoformas similares a PKC ¿, con un peso molecular de 62, 60 y 58 kDa. (Es posible que la proteína p60 purificada en el presente trabajo sea similar a alguna de estas PKC delta purificadas por Nishizuka). Debido a la utilización del molusco Aplysia como modelo para el estudio de las bases neurológicas del aprendizaje, es en esta especie donde se han caracterizado con mayor detalle las isoformas existentes de PKC. De ganglios neuronales de este molusco se han purificado dos PKCs de las cuales la llamada Apl-II posee una masa molecular de 87 kDa, mientras que la forma dependiente de calcio o Apl-I, posee una masa molecular de 74 kDa. En ambos casos menor que la de p105 y mayor que la de p60. Por la cercanía filogenética entre Aplysia y el mejillón M. galloprovincialis es probable que Apl-lI y p105 sean isoformas similares, aún a pesar de la diferencia de peso molecular. En cuanto a la relación que existe entre estas proteínas y las isoformas de mamíferos solo se puede señalar que los estudios más avanzados en Aplysia, han permitido su clonación y se ha constatado una analogía en su secuencia con PKC ¿ de mamíferos. En el presente trabajo se estudió la cinética de la proteína quinasa p60 frente a los sustratos más característicos, obteniéndose para el péptido T5 una Km de 68,12 µM, para el péptido T3 se obtiene una Km de 841,9 µM, por otro lado para la MBP se obtuvo una Km de 69,41 µM, para la Histona III-S obtuvimos una Km = 237,98 µM y por ultimo para la Protamina sulfato el valor de Km fue de 13,46 µM. Con respecto a la actividad quinasa de las proteínas p60 y p105, los parámetros cinéticos que hemos obtenido coinciden con los antecedentes descritos para nPKCs de mamíferos, las cuales fosforilan débilmente la Histona III-S y la MBP, mientras que tienen una alta afinidad por la protamina sulfato. Por tanto ha sido necesaria la utilización de péptidos sintéticos derivados de la secuencia del pseudosustrato o de MBP, o del receptor de crecimiento epidérmico (EGF), para ensayar la actividad quinasa de las nPKCs. Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio para la proteína p105 por Mercado y colaboradores, así como los obtenidos para la enzima p60 en el presente trabajo muestran que la p60 muestra una actividad hacia los diferentes péptidos sustratos ensayados del orden de 20 veces más altos que para la p105. La alta actividad fosforilante que p60 y p105 desarrollan con la protamina sulfato, podría deberse a que presenta dos sitios de fosforilación en su secuencia, PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRR, en S6 y S20, en comparación con los otros sustratos probados que solo presentan un sitio de fosforilación. Las actividades enzimáticas sugieren que p105 podría catalizar las reacciones de fosforilación de una manera similar a PKC ¿. Los valores de Vmáx obtenidos para el péptido sustrato comercial de 9 residuos (VRKRTLRRL) o (T-5) y el péptido sustrato para PKC ¿, ERMRPRKRQGSVRRRV (S-11), son similares a las que se obtienen con la PKC ¿ de mamíferos. La proteína p105 no solo es independiente de Ca2+, sino que además es inhibida por él. Esta característica ya ha sido descrita en isoformas de nPKC de mamíferos, en un tipo descrito simplemente como nPKC y en el otro que comprende a PKC ¿. Para la enzima p105 de manto de mejillón, la inhibición es de tipo mixta. Siendo preferentemente más afín por la enzima libre, Ki 0,6 mM que por el complejo enzima-sustrato, Ki¿ 2 mM. En la mayoría de células estimuladas, la concentración de Ca2+ se incrementa solo transitoriamente, mientras que las respuestas fisiológicas persisten durante un largo periodo de tiempo una vez que la concentración de Ca2+ ya retornó a concentraciones basales. La prolongada activación de PKC parece ser responsable del mantenimiento en la respuesta celular. La movilización del Ca2+ y la activación de PKC actúan sinergicamente causando una variedad de repuestas celulares, pero el mecanismo bioquímico de este sinergismo no está completamente estudiado. La movilización del Ca2+ y la degradación del fosfolípido están íntimamente relacionadas, y en ocasiones son complementarias entre si. En presencia de altas concentraciones de Ca2+, la activación de PKC requiere de una pequeña degradación fosfolipídica, así como en presencia de una intensa degradación fosfolipídica se requiere de una pequeña cantidad de Ca2+ para activar la enzima. Por otra parte en este estudio, hemos determinado que p60 no solo es dependiente de Ca2+, sino que se ha comprobado que la concentración óptima de Ca2+ para esta enzima es de 0,65 mM. En este trabajo, también hemos estudiado los efectos de inhibición provocados sobre p60 por inhibidores que compiten por la unión del ATP (como la estaurosoporina, para la cual se obtuvo una Ki = 20,3 µM o la bisindolilmaleimida, para esta el valor de la cte de inhibición fue de Ki = 1,765 µM), también se ensayó el efecto producido por inhibidores de la interacción PKC/fosfolípido (En nuestro caso se utilizó la curcumina como agente representativo de este grupo de inhibidores y se obtuvo una Ki = 13,16 µM). Se observa que para los tres casos se obtiene una inhibición de tipo competitiva. En el nematodo Caenorhabditis elegans, la actividad de PKC fue inhibida por los inhibidores de proteína quinasa H7 y estaurosporina. Se obtuvo una inhibición máxima para concentraciones que oscilaban entre 9 µM y 8 nM respectivamente. Se ha confirmado que los inhibidores H7 y un inhibidor específico del péptido de PKC RFARKGALRQKNVHEVKN inhiben la fosforilación del péptido estimulada por el Ca2+ / fosfolípido en más de un 98%. Para profundizar en la caracterización de las enzimas se obtuvieron anticuerpos policlonales contra p60 y p105. Los anticuerpos obtenidos son específicos para las proteínas puras, y no se observó reacción cruzada en las inmunodetecciones realizadas para las dos isoformas purificadas frente a los respectivos anticuerpos. El análisis de p105, evidenció una característica que la proteína comparte con otras nPKCs descritas en mamíferos, PKC ¿, PKC ¿ y PKC ¿. Todas estas isoformas presentan una doble banda, detectada mediante Western blotting, que es habitualmente un indicador de un estado diferencial de fosforilación, detectable en extractos crudos de tejidos. Con respecto a las inmunodetecciones, p105 presentó fosforilaciones en Ser, no presenta fosforilaciones en Tyr y fue reconocida por anti PKC ¿ y con mayor nitidez por anti PKC ¿. Esto último nuevamente refuerza la idea de que existe una similitud entre p105 y la isoforma PKC ¿ de mamíferos, y se podría decir que aparentemente existen secuencias aminoacídicas comunes entre ambas proteínas. Por otro lado, a diferencia de p105 para p60 solo se detectó una banda y al igual que p105, presentó fosforilaciones en Ser, no presentó fosforilaciones en Tyr y fue reconocida por anticuerpos contra isoformas cPKC (¿ y ß) de mamíferos. Al ser considerados los hemocitos de invertebrados semejantes a los macrófagos de vertebrados se cree que, deben de comportarse de forma similar a ellos. Los inductores utilizados en hemocitos fueron un antígeno (LPS, lipopolisacárido asociado a la membrana de bacterias Gram-negativas) y dos citoquinas (interleuquina 2 y PDGF o factor de crecimiento derivado de plaquetas). Tanto las concentraciones como los rangos de tiempo utilizados en las incubaciones con los tres inductores se eligieron basándose en estudios previos, en los cuales para dichos parámetros se había conseguido la mayor liberación de catecolaminas y síntesis de oxido nítrico por los hemocitos. Estas moléculas parecen activar a los hemocitos induciendo un aumento de la motilidad y superficie celular e incrementando la síntesis de aminas biógenas. Al igual que sucede con los diferentes tipos celulares de vertebrados, la respuesta de hemocitos de M. galloprovincialis varía según el inductor utilizado. El estudio de la expresión proteica de hemocitos incubados con los inductores (LPS, IL-2 y PDGF) refleja cierta diversidad en los patrones electroforéticos. En las electroforesis realizadas con los diferentes inductores ensayados se detectaron múltiples bandas de proteínas en la fracción citosólica, siendo dos proteínas con un peso de 66 y 48 kDa respectivamente, las que mostraron una mayor expresión. Estas dos bandas de proteínas también fueron las que presentaron la mayor intensidad en la fracción de membrana. En la fracción citosólica la banda de 48 kDa no presentó variaciones significativas excepto cuando los hemocitos se incubaron con LPS, donde se observó que para tiempos de incubación muy cortos (30 segundos y 1 minuto) la banda detectada fue más intensa, mientras que para tiempos de incubación más prolongados (45 minutos y 60 minutos) la banda detectada mostró una intensidad más baja. En cuanto a la banda de 66 kDa, su expresión reflejó cambios para los distintos inductores empleados; lo más destacado fue que en el caso del LPS para tiempos de incubación largos (45 minutos y 60 minutos) la banda mostró una intensidad más baja que en el resto de condiciones ensayadas y en las incubaciones con PDGF a partir de los 5 minutos de incubación se produce un aumento en la intensidad de la banda. En cambio, Novás, (2005) había obtenido una mayor expresión para tres bandas de proteínas cuyos pesos moleculares eran de 108, 85 y 71 kDa respectivamente, tanto en invierno como en verano. Novás, (2005) también observó durante los dos años posteriores al desastre ecológico (vertido de fuel por el Prestige) ocurrido en las costas gallegas un cambio en la expresión proteica de los hemocitos en las inmunodetecciones realizadas con anti iNOS humana y anti eNOS bovina. Además comprobó que la producción de oxido nítrico se anulaba durante estos años (2003 y 2004). Aunque el LPS no induce la síntesis directa de óxido nítrico, en hemocitos se conoce la implicación de esta molécula en la liberación de catecolaminas, las cuales ya habían sido detectadas anteriormente en varios tejidos de moluscos y en hemolinfa de moluscos gasterópodos. Incluso existen diversos estudios que afirman que las catecolaminas de invertebrados poseen las mismas características que las presentes en vertebrados. Cao (2002), observó en hemocitos de mejillón M. galloprovincialis, un incremento en la producción de catecolaminas después de la incubación de estas células con LPS, PDGF, ACTH 1-24, ACTH, IL-2, TGF-ß 1 y CRF en diferentes épocas del año. La IL-2 modula la actividad fagocítica de los hemocitos, y junto con IL-1¿ y ß y TNF-¿ y ß está implicada en la liberación de aminas biógenas, un fenómeno considerado como un tipo ancestral de respuesta al estrés. En vertebrados la IL-2 desempeña un papel fundamental en la proliferación de las células T al unirse a un receptor específico que se expresa en la superficie celular. Además la IL-2 modula las funciones inmunológicas de células T, B y NK con lo que podemos concluir que desempeña un papel fundamental en la fisiología del sistema inmune. En invertebrados, la IL-2 induce activaciones en células de la hemolinfa, aunque las activaciones son menos potentes que las inducidas por IL-1 o CRF, ésto es particularmente notorio en el caso de la síntesis de aminas biógenas promovidas por citoquinas. Novás (2005), determinó en experimentos realizados en nuestro laboratorio que la mayor producción de NO se produce cuando los hemocitos se incubaban con IL-2 (0,1 ¿g/ml) durante 24 horas. Las inmunodetecciones realizadas con anti p105 en hemocitos incubados con IL-2 (0,01 ¿g/ml) revelaron la presencia en el citosol de una doble banda (105 y 108 kDa) para todos los casos estudiados, mientras que en la membrana se observó que la doble banda desaparecía al cabo de una hora de incubación con IL-2. Estos resultados son coincidentes con los obtenidos por Novás et al., (2007a) para las diferentes épocas del año y con los obtenidos por Cao (2002) en el periodo estival (abril-agosto), aunque son opuestos a los que Cao obtuvo para el periodo invernal (septiembre-marzo) cuando la estimulación con el inductor fue de 30 minutos de duración. Lu y Durkin (1997) llegaron a la conclusión de que la estimulación con este efector no conducía a una translocación de la PKC a la membrana. Cabe mencionar que todos los hemocitos con los que se ha trabajado en el presente trabajo se obtuvieron durante el periodo invernal. Además recientes patrones meteorológicos apuntan a que el cambio climático global ya está teniendo un impacto en España y es probable que las artes de pesca destructivas, el deterioro progresivo del litoral, la contaminación marina y el imparable cambio climático estén provocando cambios en la respuesta de los seres que componen los ecosistemas marinos, y probablemente por ello existe una gran variabilidad en la respuesta de los hemocitos del mejillón Mytilus galloprovincialis Lmk. durante los últimos años. Cuando los hemocitos se incubaron con diferentes concentraciones de IL-2 durante 24 horas, en el citosol se detectaron dos bandas para las diferentes condiciones ensayadas. En la membrana se observa como la doble banda detectada presenta una intensidad más elevada con la concentración más elevada de las ensayadas (0,1 ¿g/ml); posteriormente la intensidad de las dos bandas disminuye de forma paralela a la concentración, y una vez se alcanza el mínimo en la intensidad para una concentración de 1,5x10-3 ¿g/ml, la intensidad de las bandas comienza a recuperarse a pesar de que la concentración del inductor continua descendiendo. Con respecto a las inmunodetecciones realizadas con anti p105 en hemocitos incubados con LPS se observó que la doble banda detectada en la fracción citosólica presentaba diversas fluctuaciones en su intensidad. Lo más destacado es que la banda de 108 kDa presentaba una intensidad mucho más elevada cuando se empleaban tiempos de incubación muy cortos (30 segundos y 1 minuto) que en el resto de los casos. Por otro lado en la fracción de membrana se observa como la banda de 105 kDa es mucho menos intensa cuando el tiempo de incubación fue de 60 minutos y la banda de 108 kDa disminuyó su intensidad a partir de 1 minuto de incubación con LPS. Los resultados obtenidos en la fracción de membrana difieren de los obtenidos por Cao et al., (2004b) tanto en invierno como en verano puesto que en los ensayos que realizaron no se detectó la expresión de bandas, y en cambio se asemejarían a los obtenidos por Novás et al., (2007a) durante el periodo invernal, ya que tan solo detectó la presencia de una banda de 105 kDa en esta fracción. Por último, cuando se utilizó PDGF como inductor en las inmunodetecciones realizadas con anti p105 podemos destacar que en la fracción de membrana la doble banda tan solo se detectó para tiempos de incubación de 30 segundos y 30 minutos, resultados coincidentes con los de Novás et al., (2007a) al emplear 15 minutos de incubación. En el citosol existe una gran variación en cuanto a la intensidad de la banda detectada y lo más reseñable es que a los 15 minutos de incubación la banda de 108 kDa presenta una menor intensidad. Los resultados obtenidos en la fracción citosólica son idénticos a los obtenidos por Cao et al., (2004a) y Novás et al., (2007a) durante el periodo invernal, mientras que para la membrana difieren de los obtenidos por Cao et al., (2004a) en el mismo periodo, puesto que se encontró que la estimulación de hemocitos con PDGF bloqueaba la translocación de p105 a la membrana, al igual que ocurría para el LPS. Analizando estos resultados podemos destacar dos aspectos importantes en la respuesta de los hemocitos: 1) En la fracción citosólica, se detectaron dos bandas de 105 y 108 kDa para todos los controles, mientras que en la fracción de membrana tan solo se detectó la banda de 105 kDa. Como se comentará más adelante esto es coherente con los resultados obtenidos en otros trabajos puesto que en esta fracción se encuentran preferentemente las especies de PKC defosforiladas o fosforiladas en el asa de activación. 2) Cuando los hemocitos fueron estimulados con diferentes inductores (IL-2, LPS y PDGF) en la fracción de membrana se obtuvo una respuesta muy variable que fue dependiente del tiempo de incubación y en el caso de la IL-2 también fue dependiente de la concentración utilizada. La inmunidad varía entre diferentes grupos de animales pero siempre va a actuar rápida y eficazmente contra un amplio rango de patógenos diferentes (ejemplo: virus, bacterias, hongos, y parásitos eucarióticos). Los invertebrados carecen de respuestas inmunes adaptadas que son características de mamíferos, pero poseen una respuesta inmune innata que incluye la acción de componentes humorales y celulares. El papel de las PKCs en la respuesta inmune innata de los mamíferos ha sido el centro de gran parte de investigaciones y, en los macrófagos, se ha demostrado que esta familia de enzimas regula procesos tales como la adhesión y la difusión celular, la fagocitosis, y la producción de especies reactivas de oxígeno e intermediarias de nitrógeno. Parece que la estimulación de los hemocitos también provocó al menos dos tipos de respuestas. Los hemocitos estimulados con diferentes inductores, en primer lugar presentaron una respuesta inmediata, dando lugar a la expresión de dos bandas de 105 y 108 kDa a los 30 segundos de incubación, como ocurrió cuando se estimularon los hemocitos con LPS o PDGF. Posteriormente la respuesta tiende a regularizarse apareciendo expresada únicamente una banda de 105 kDa. Finalmente, se produce una respuesta tardía que en el caso de la estimulación con PDGF se produjo a los 30 minutos de incubación con el inductor, detectándose de nuevo dos bandas de 105 y 108 kDa. En el caso de estimulaciones con IL-2 y LPS tras 60 minutos de estimulación la doble banda no se detectó probablemente debido a una down-regulation. Se ensayaron diferentes concentraciones de IL-2 y se observó que la mejor respuesta se obtenía para la misma concentración de IL-2 con la que Novás, (2005) había obtenido una mayor producción de NO (0,1 ¿g/ml) por los hemocitos, mientras que Cao et al., (2002) observó que la mayor producción de adrenalina y noradrenalina se producía para una concentración diez veces más baja (0,01 ¿g/ml). En este trabajo, también se observó una buena respuesta para la concentración de IL-2 más pequeña de las ensayadas (2,5x10-4 ¿g/ml). Parece que los hemocitos tendrían al menos dos sitios de unión para la IL-2. Uno de estos lugares tendría una afinidad por la IL-2 muy elevada y el otro una afinidad menor. De este modo, una exposición a IL-2 durante un tiempo prolongado implicaría el reconocimiento del inductor por ambos sitios de unión, como ocurriría también al emplear altas concentraciones del inductor; mientras que la exposición de los hemocitos frente a la IL-2 durante un tiempo limitado supondría que el inductor tan solo podría unirse al lugar de mayor afinidad, al igual que ocurre cuando se utilizan bajas concentraciones de IL-2. Por otra parte en las inmunodetecciones realizadas con el anticuerpo anti p60, se observó una expresión bastante compleja para los diferentes inductores empleados. Cuando los hemocitos se incubaron con IL-2 (0,01 ¿g/ml) en la fracción citosólica se observó la presencia de una única banda de 60 kDa cuya intensidad aumentó progresivamente desde el minuto 1 de incubación hasta el minuto 45; a los 60 minutos se produjo un descenso en la intensidad de la proteína. Por tanto, cuando los hemocitos se estimulan durante 60 minutos con IL-2 se produce una depleción de p60 en la fracción citosólica, pasando a detectarse únicamente en la fracción de membrana. En cambio, para la fracción de membrana el aumento en la intensidad fue progresivo desde el minuto 1 hasta el minuto 5, a partir de aquí la intensidad disminuye y cuando se alcanzan tiempos de incubación mayores (45 y 60 minutos) la intensidad de la banda se mantiene constante. Cuando se realizaron inmunodetecciones con anti p60 en hemocitos estimulados con IL-2 durante 24 horas no se apreciaron cambios en la expresión de la enzima en la fracción citosólica. En la fracción de membrana podemos destacar la presencia de un aumento importante en la banda detectada para una concentración de IL-2 de 0,05 ¿g/ml, mientras que para las concentraciones con las que previamente Novás et al., (2005) y Cao et al., (2002) habían obtenido una mayor producción de NO y una mayor síntesis de catecolaminas no se observan cambios con respecto al control. En las inmunodetecciones realizadas con anti p60 para hemocitos incubados con LPS la respuesta obtenida es bastante compleja. Así, en la fracción citosólica inicialmente no se observan cambios, entre los 3 y los 15 minutos de incubación se produce un descenso en la intensidad de la banda detectada y a partir del minuto 30 de incubación la intensidad aumenta llegando a superar los niveles de intensidad iniciales. En la fracción de membrana para periodos de incubación cortos se observa un aumento de la intensidad de la banda con respecto al control, mientras que a partir de los 5 minutos la intensidad de la banda detectada es bastante menor. Posiblemente a partir de los 3 minutos de estimulación con LPS se produzca una down regulation de la enzima, que produzca una disminución de p60 en la membrana y su aumento en la fracción citosólica. Con respecto a los hemocitos incubados con PDGF, las inmunodetecciones con anti p60 no reflejaron cambios en la expresión de la banda de 60 kDa para la fracción citosólica. En la membrana en cambio se observó un aumento de la intensidad para las incubaciones de 30 y 60 minutos. Además, tampoco se encontraron diferencias en el estado de fosforilación de las bandas de 105 y 108 kDa al realizar las inmunodetecciones con el anticuerpo anti P-Serina tras estimular los hemocitos con los diferentes inductores ensayados. Se detectaron fosforilaciones en los residuos de serina de las proteínas estudiadas para todas las condiciones ensayadas. La banda de 105 kDa aparece prácticamente en todos los ensayos realizados con los distintos inductores (IL-2, PDGF, LPS) tanto en citosol como en membrana con el anticuerpo anti p105, mientras que en la fracción de membrana en algunos casos la banda de 108 kDa no se detecta. Además la banda de 105 kDa aparece en todos los pasos de purificación al igual que ocurría en los resultados de Mercado (2001) y sin embargo la banda de 108 kDa en la cromatografía con HTP no aparece. Análisis de espectrometría de masas, junto con análisis de fosforilación en sitios mutantes y el uso de anticuerpos fosfo-específicos, ha permitido establecer que las bandas que migran más rápido representan a la PKC no fosforilada o fosforilada exclusivamente en el asa de activación (en nuestro caso sería la banda de 105 kDa), en ocasiones aparece una banda intermedia que representa a la proteína fosforilada en la Thr 641 pero no en Ser 660, y las especies que migraron menos representan a la enzima madura, es decir, fosforilada en ambos residuos del extremo carboxilo terminal, Thr 641 y Ser 660, como ocurre con la banda de 108 kDa. Aproximadamente la mitad de las especies maduras están fosforiladas en el asa de activación Thr 500, una modificación que no afecta a la movilidad electroforética de la enzima. Mercado, (2001) había obtenido la expresión de una única banda de 105 kDa para la enzima p105 tras su paso por la columna de HTP así como para las incubaciones realizadas con el anticuerpo anti P-serina. Por ello afirmaba que p105 era capaz de autofosforilarse en residuos Ser. Además creía que la banda de 108 kDa correspondería a la forma no fosforilada de la enzima, puesto que no había encontrado fosforilaciones en Ser en las inmunodetecciones realizadas con el anticuerpo anti P-Serina. Por ello, creía que la presencia de esta banda de 108 kDa se debería probablemente a una defosforilación de la banda de 105 kDa. En cambio, los resultados obtenidos con el anticuerpo anti P-serina en el presente trabajo son contrarios a los obtenidos por Mercado, 2001 pero coincidentes con los obtenidos en trabajos realizados por otros investigadores. Por tanto, la banda de 105 kDa correspondería a la fracción de la población de enzima que estaría defosforilada o fosforilada exclusivamente en el asa de activación. Por otro lado, la banda de 108 kDa correspondería a las especies de esta enzima que se encuentran fosforiladas en ambos residuos del extremo carboxilo terminal y en un 50% de los casos fosforiladas también en el asa de activación. Con respecto a p60, se detectaron fosforilaciones a nivel de residuos de serina en las incubaciones realizadas con los distintos inductores y no se observaron diferencias en el grado de fosforilación. En cuanto a la distribución tisular de p105, ésta se encontró en todos los tejidos estudiados, tanto en la fracción citosólica como en la fracción de membrana. Se observó que p105 es mayoritaria en la fracción citosólica. p60, al igual que p105 también se encontró en todos los tejidos estudiados. Sin embargo en la fracción de membrana de músculo aductor posterior (PAM) p60 no fue detectada y en el músculo del pie su expresión fue menor a la de otros tejidos. Al igual que para p105, la presencia de p60 fue mayoritaria en la fracción citosólica, y en esta fracción prácticamente no hay diferencias de expresión entre los diferentes tejidos estudiados. En la fracción de membrana, p60 fue mayoritaria en manto y branquias. También podemos subrayar que en el caso de los hemocitos, la banda de 60 kDa detectada fue más intensa en el citosol que en la membrana, y que las bandas son más tenues que en el resto de tejidos estudiados. Como última aproximación a la caracterización de las enzimas, se estableció otro parámetro de comparación, que fue el estudio de la respuesta de p105 y p60 a ésteres de forbol. Para ello se trabajó con un modelo celular aislado del propio mejillón, los hemocitos, los efectores celulares de la inmunidad en invertebrados, con funciones primitivas, tales como la fagocitosis o el ataque lítico u oxidativo ante patógenos. PMA es una molécula capaz de unirse a las PKCs, de una manera prácticamente selectiva, e inducir la translocación de la enzima. Al observar el patrón electroforético de hemocitos estimulados con PMA se observa la expresión de múltiples bandas de proteínas en la fracción citosólica, siendo tres bandas con pesos de 66, 60 y 48 kDa respectivamente las que presentaron una expresión más notoria tanto en el citosol como en la membrana. En la fracción de membrana las bandas de 60 y 48 kDa aparecen con una intensidad muy tenue. Una vez comprobado el patrón de distribución electroforética de hemocitos estimulados con PMA se procedió a estudiar la respuesta que presentaban frente a los anticuerpos anti p105 y anti p60 obtenidos para las dos proteínas purificadas. En hemocitos del molusco bivalvo M. galloprovincialis estimulados con PMA, la proteína p105 aparece para todas las condiciones ensayadas en la fracción citosólica, mientras que en la fracción de membrana su expresión disminuye o incluso llega a desaparecer cuando se incrementa el tiempo de incubación o la concentración de PMA. Por tanto en la membrana, cuando los hemocitos se estimulan con PMA 160 nM durante 60 minutos posiblemente se produzca una regulación por degradación o down regulation de p105, resultado similar al encontrado por Mercado, (2001) para incubaciones de PMA 80 nM durante 60 minutos y también es un proceso común en células de mamíferos. En monocitos humanos, tras 30 minutos de estimulación con PMA 1 nM, la situación se invierte, PKC ¿ aparece mayoritariamente en el citosol, al igual que ocurre con p60 a los 30 minutos en hemocitos estimulados con PMA 160 nM. En hemocitos estimulados con PMA, la proteína p60 se transloca a la membrana plasmática, tal como ocurre con las PKCs en células de mamíferos. En monocitos humanos, PKC ¿, PKC ßII y PKC ¿ aparecen translocadas a la membrana plasmática, a los 15 minutos de estimulación con PMA 1 nM, tal como ocurre con p60. Tras el análisis de los resultados obtenidos en este trabajo llegamos a las siguientes conclusiones: CONCLUSIONES 1 A partir del manto del mejillón Mytilus galloprovincialis se han purificado dos proteínas; la primera con un peso aproximado de 60 kDa (p60), presenta actividad quinasa dependiente de fosfatidil L-serina, PMA y calcio. La segunda con un peso de 105 kDa (p105), presenta actividad quinasa dependiente de fosfatidil L-serina, PMA y es independiente de calcio. 2 De los diferentes sustratos ensayados, la protamina sulfato fue el péptido sustrato por el que la enzima p60 mostró la mayor afinidad; sin embargo, el péptido (VRKRTLRRL) fue el mejor sustrato en los ensayos de actividad enzimática puesto que presentó la mejor eficiencia catalítica (Vmáx/Km). A diferencia de p60, el sustrato por el que la enzima p105 mostró la mayor afinidad fue la MBP, aunque el mejor sustrato en los ensayos de actividad enzimática fue la protamina sulfato al presentar la mejor eficiencia catalítica. 3 Los tres inhibidores ensayados con la enzima p60 de manto de mejillón Mytilus galloprovincialis Lmk, Bisindolilmaleimida y estaurosporina (inhibidores con respecto a la unión a ATP) y curcumina (inhibidor con respecto a la unión de L-¿ fosfatidilserina) ejercieron una inhibición de tipo competitivo. 4 Tras estudiar la distribución tisular de p60 hemos comprobado que la enzima está presente en la fracción citosólica de manto, branquias, hepatopáncreas, pie, músculo aductor y hemocitos de Mytilus galloprovincialis. Sin embargo en la fracción de membrana del músculo aductor posterior (PAM) p60 no fue detectada y en el músculo del pie su expresión fue menor a la de otros tejidos. Parece que en la fracción de membrana p60 se encuentra predominantemente en tejidos no musculares como el manto y las branquias, mientras que p105 se encuentra mayoritariamente en las branquias y en el resto de tejidos se encuentra distribuida por igual. 5 En las inmunodetecciones con anti p105 se ha visto que al estimular los hemocitos con diferentes inductores, pueden presentar dos tipos de respuesta; una respuesta inmediata y otra más tardía. En las estimulaciones con IL-2 se ha comprobado que los hemocitos parecen poseer dos sitios de unión para la IL-2, uno con alta afinidad por el inductor y otro con baja afinidad. 6 En las inmunodetecciones con anti p60 la respuesta de los hemocitos frente a los distintos inductores empleados (IL-2, PDGF y LPS) conduce a cambios en la distribución de p60 tanto en la fracción citosólica como de membrana. 7 Se ha comprobado que p60 y p105 presentan residuos fosforilables en P-Ser. Hemos probado que p105 se fosforila en las dos bandas de 105 y 108 kDa. 8 La estimulación de hemocitos con PMA induce la translocación de p60 a la membrana plasmática y se regula por degradación en función del tiempo de exposición.