Desarrollo de métodos para el aislamiento y la detección de toxinas marinas en productos de la pesca y la acuicultura

Resumen

El objetivo de la presente tesis doctoral fue desarrollar métodos para el aislamiento y la detección de ficotoxinas marinas. Se puso a punto la polarización de la fluorescencia (FP) como técnica analítica base para diseñar métodos rápidos y asequibles de detección de toxinas. Se estudió la unión entre las yessotoxinas (YTXs) y las fosfodiesterasas celulares mediante la FP, con el fin de obtener un método para cuantificar estas ficotoxinas. Además se pusieron a punto métodos de extracción y limpieza de las YTXs a partir de muestras contaminadas. En el laboratorio de Farmacología se había descrito con anterioridad la unión entre las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos celulares y las YTXs. Basándose en este hecho se utilizó la FP para diseñar un método de detección de este grupo de toxinas. En primer lugar se puso a punto esta tecnología analítica estudiando la unión de avidina y biotina, marcando una de las dos especies con un derivado fluorescente. A continuación se utilizó la FP para detectar la unión de la YTX y las fosfodiesterasas I y II marcadas con un derivado de la fluoresceína, observando que era posible cuantificar la cantidad de toxina existente en un medio control. Posteriormente se realizó un análisis de los distintos métodos de extracción de las YTXs a partir de muestras de mejillón contaminado, determinando cuáles eran los más adecuados por no presentar efecto matriz en el método de detección. Durante este análisis también se diseñó un procedimiento de limpieza para reducir las interferencias de los extractos en la FP. Finalmente el conjunto formado por el método de extracción y limpieza y el método de detección se validó con muestras de mejillón contaminado durante una marea roja, observándose que no sólo era adecuado para cuantificar la yessotoxina presente en la muestra, sino también otros análogos como la homoyessotoxina y la hidroxiyessotoxina. Por otro lado, se desarrolló un procedimiento para la purificación a gran escala de azaspirácidos (AZAs) a partir de mejillones contaminados con varias toxinas lipofílicas y se investigó la estabilidad de las toxinas obtenidas. La finalidad de este estudio era disponer de elevadas cantidades de compuestos puros para obtener estándares de alta calidad. En el laboratorio de Farmacología se disponía de mejillones contaminados con toxinas DSP y AZAs procedentes de una marea roja de Irlanda. Con este material se puso a punto un método de purificación a gran escala de los diferentes análogos de AZAs. Se diseñó un procedimiento que consta de tres etapas consecutivas: una extracción de la muestra de mejillón con varios disolventes orgánicos, una separación en fase sólida para aislar los AZAs de las toxinas DSP y una cromatografía líquida para purificar cada uno de los análogos. En el transcurso de la purificación se observó una relación entre la estabilidad de los AZAs y la temperatura de secado durante el proceso de separación. Por ello se llevó a cabo un estudio sobre la influencia de la temperatura y el pH en la estabilidad de los distintos análogos aislados. De los resultados obtenidos se extraen las siguientes conclusiones: 1. La polarización de la fluorescencia sirve para detectar la unión entre las fosfodiesteras y la yessotoxina. 2. La polarización de la fluorescencia permite cuantificar la yessotoxina, la homoyessotoxina y la hidroxiyessotoxina en una muestra. Para ello es indispensable seguir un procedimiento de limpieza con una extracción en cartucho de sílica y un filtro para pesos moleculares menores de 10000, precedido de una extracción con metanol o de una extracción con acetona y particiones con diclorometano. 3. La acetona y el metanol separan las toxinas diarreicas de los azaspirácidos mediante una extracción en fase sólida con cartucho de sílica. 4. La fase móvil MeOH/H2O/AcOH (700/300/1) es la más adecuada para purificar mediante cromatografía líquida los azaspirácidos 1-5. 5. Elevadas temperaturas (mayores de 40ºC) y valores de pH extremos (menores de 1 y mayores de 12) modifican la estructura molecular de los azaspirácidos en disolución y eliminan su actividad tóxica. Sin embargo, los tejidos de moluscos en los que se encuentran ejercen un efecto protector frente a dichas variables.