Sobreexpresión y degradación de Protimosina alfa en células de tiroides de rata (FRTL-5)

Zusammenfassung

En esta tesis intentamos encontrar nuevas evidencias que nos permitieran conocer la función de Protimosina alfa (PTA). PTA es una pequeña proteína nuclear de aproximadamente 12kD., sumamente acídica cuya función es desconocida. En diversos modelos experimentales se ha visto que existe una correlación entre los niveles de PTA y su actividad proliferativa, así los niveles de PTA son mayores en células que se dividen más activamente como también en tumores, y por ello, es utilizado como marcador tumoral. En el presente trabajo caracterizamos inmunológicamente el anticuerpo anti-PTA a fin de desarrollar técnicas como el western blot y la inmunofluorescencia. Una vez caracterizado, y tras poner a punto técnicas como la inmunofluorescencia, encontramos que la expresión de PTA disminuye en células en quiescencia. Mediante microscopía electrónica observamos como en Mitosis (profase tardía) la proteína disminuye en el citoplasma. La posibilidad de que esta disminución se debiera a la proteolisis de la proteína, nos indujo a estudiar la degradación de PTA. Observamos que la actividad proteolítica depende del estadío celular, siendo mayor en mitosis y en células serodeprivadas. Esta degradación de PTA en las células en Mitosis es debida a una cisteín proteasa neutra, no liosomal, dependiente de calcio (una calpaína). Ambas isoformas micro y milicalpaína degradan PTA. La degradación de PTA por calpaína "in vitro" origina tres fragmentos, localizándose los puntos de corte en la región N-terminal como se observó mediante Western blot y espectrofotometría de masas (MALDI-TOF). Uno de los puntos de corte podría ser el responsable de la obtención de la forma des(25-28) Timosina alfa1. Este sistema de degradación podría ser el responsable de la degradación "in vivo" dada que el mismo patrón de degradación fue obtenido en extratos celulares. Existen numerosos casos en los que este sistema coopera c