Análisis funcional de protimosina alfa en cultivos celulares

Resumo

Protimosina alfa (PTA) es una proteína nuclear de función desconocida. En diversos modelos experimentales se ha constatado su relación con la proliferación celular y de ellos se puede deducir que PTA es necesaria, aunque no suficiente para la proliferación celular. En el presente trabajo se planteó como objetivo la realización de un estudio funcional de PTA. Para ello, se ha puesto a punto la caracterización inmunológica de PTA en extractos celulares mediante Western blot. Para la inmunodetección de PTA es necesaria la utilización de membranas cargadas positivamente, como la DEAE-celulosa, ya que las restantes membranas probadas no retienen la proteína. Se emplearon dos anticuerpos diferentes, que reconocen distintas regiones de la molécula. Aunque con distintas eficacias, ambos anticuerpos son capaces de detectar en Western blot la PTA nativa intracelular de modo específico, as] como de inmunoprecipitarla. Se han cuantificado los niveles de PTA en extractos celulares, encontrando que estos niveles son mayores en células proliferantes que en células no proliferantes. En paralelo, se caracterizaron proteínas asociadas a PTA en extractos celulares. Los resultados obtenidos en experimentos de afinidad utilizando la proteína de fusión GST-PTA no son fisiológicamente concluyentes. Por contra, el estudio y caracterización de proteínas celulares asociadas a PTA demuestran que PTA se asocia in vitro, de modo directo, a la histona H1, tanto en Far Western blot como en solución. El anticuerpo anti-PTA coinmunoprecipita cuatro proteínas con pesos moleculares estimados de 95, 70, 30 y 26 kDa. La presencia de estas proteínas en los inmunoprecipitados está regulada en el ciclo celular. Por otro lado, los resultados obtenidos del estudio del efecto de PTA sobre el patrón de fosfoproteínas en extractos celulares son indicativos de que PTA participa en la acción del Ca2+ sobre la proliferación celular, ya que PT