Proteín quinasa C en rodaballo (Scophthalmus maximus)caracterización y expresión de tejidos

Resumo

En este trabajo, se ha aislado una actividad proteín quinasa C a partir de bazo de rodaballo mediante tres pasos cromatográficos: DEAE, fenil-sefarosa y treonín-sefarosa. La actividad era calcio-fosfolípido dependiente, se inhibía por H7 y en western blot se obtenían dos bandas, una de 80 y otra de 100 kDa. con el monoclonal MC5. Las concentraciones óptimas de activadores para su plena actividad eran 0.1 mM calcio, 20 microg/ml fosfatidilserina y 2 microg/ml diacilglicerol. La PKC purificada fosforiló con alta eficiencia dos sustratos específicos: MARCKS151-175 y EGFR651-658, y fue inhibida específicamente por dos péptidos pseudosustrato: PKC19-36 y PKC19-31. Por western blot, se demostró que la actividad purificada contenía seis isoformas: alfa, beta, delta, epsilon, zeta y lambda, mientras que en extracto crudo de bazo se detectaron las seis anteriores, mu y theta. Alfa presentaba dos formas de distinto peso molecular, una de 80 y otra de 100 kDa. Cargando la actividad purificada en una Mono Q, se obtuvieron dos picos de actividad, en uno de los cuales están presentes delta y lambda. El análisis de la expresión de isoformas de PKC en diferentes tejidos de rodaballo: hígado, gónada, músculo, corazón, cerebro, intestino, aleta caudal y riñón; demostró que las isoformas alfa (con una masa de 100 kDa.), beta, delta, epsilon, lambda y mu, están presentes en todos los tejidos. Zeta se detectó en todos salvo en músculo, mientras que gamma y theta están presentes en cerebro y en músculo y cerebro, respectivamente.