Clonación y caracterización del gen que codifica la proteína Tbp2 en Neisseria sicca P183

Resumo

El presente trabajo de tesis doctoral se divide en 3 partes. En una primera parte se caracterizan las cepas disponibles y eligen una cepa comensal (N. Sicca P183) y una cepa meningocócica (N. Meningitidis v14) para la clonación del gen Tbpb. En esta parte de caracterización, se determina también el tamaño de la proteína Tbp2 en las dos cepas elegidas (77 kDa para N. sicca p183 y 83 kDa para N. meningitidis v14). En la segunda parte se describe la construcción de una genoteca de ADN cromosómico de N. meningitidis v14 en el plásmido pUC8 utilizando el método de la "perdigonada". Se describe también el examen de la genoteca utilizando tres técnicas diferentes: la detección de la proteina activa utilizando un conjugado de transferrina peroxidasa, la deteccion de una fraccion inmunogenica de la proteina utilizando un suero policlonal y la detección del gen mediante hibridación utilizando nucleotidos diseñados a partir de la secuencia del extremo aminoterminal de la proteina previamente purificada. No se detecto ningun recombinante positivo utilizando estas 3 tecnicas. En la tercera parte se describe la clonacion del gen tbpb de n. Sicca p183. Para esta clonacion se utilizaron dos estrategias: La clonacion directa de adn especifico de n. Sicca p183, utilizando como sonda un oligonucleotido diseñado a partir de la secuencia amino-terminal de la proteina tbp2 de n. Meningitidis. V14 y la clonacion previa amplificacion del gen mediante pcr. Mediante la primera tecnica se detecto un recombinante que aunque hibridaba con el oligonucleotido, no portaba el gen tbpb. Con la segunda tecnica si se clono el gen tbpb de n. Sicca p183.Confirmada la identidad del inserto clonado, se procede al análisis de su secuencia y a la comparación de la misma con la de otros genes tbpb de diversas cepas de neisseria.