Caracterización biofísica y mecánica de neuronas proprioceptoras en ratón

Zusammenfassung

Los estímulos mecánicos evocan algunos de los procesos fisiológicos más importantes en muchos organismos, incluyendo los seres humanos. En los mamíferos, las células mecanosensoras son aquellas que responden al tacto, al sonido, a la aceleración, al estiramiento de los músculos tendones y articulaciones y a los cambios en la presión sanguínea. La respuesta mecánica de las terminaciones nerviosas periféricas pueden evocar dos tipos de sensaciones: táctil y propioceptiva, cuando los estímulos son de baja intensidad y activa exclusivamente mecanorreceptores y sensaciones dolorosas, cuando la intensidad alcanza un umbral de daño o dolor, provocando que se activen los nociceptores. En los últimos años algunos miembros de los canales TRP (Transient Receptor Potential) y las proteínas de la familia Piezo, se han propuesto como mecanosensores o como participantes en la transducción de los estímulos mecánicos. Sin embargo, a pesar de algunos progresos, se desconocen las moléculas y los mecanismos que permiten a las neuronas diferenciar entre los estímulos nocivos e inocuos. El objetivo de este proyecto fue caracterizar las propiedades de las neuronas mecánicas de bajo umbral e identificar las entidades moleculares que median la sensibilidad mecánica en esta población de neuronas. Para ello, estudiamos las propiedades eléctricas y mecánicas de las neuronas del núcleo mesencefálico del trigémino (MTN). El MTN está formado por neuronas propioceptoras y es la única población de neuronas sensoriales localizada en el sistema nervioso central. Estas neuronas reciben señales originadas de los mecanorreceptores de los husos musculares del músculo masetero y de los presorreceptores dentales. Las neuronas del MTN se identificaron mediante la inyección retrograda de los marcadores DiI y FM1-43. Posteriormente, se caracterizaron sus propiedades eléctricas y mecánicas utilizando la técnica de patch-clamp en célula entera en rodajas de cerebro de ratón. La aplicación del estímulo mecánico se realizó mediante el desplazamiento de una pipeta de vidrio controlada por un sistema piezoeléctrico. Encontramos que prácticamente todas las neuronas del MTN muestran un patrón de descarga de potenciales de acción fásico a la inyección de corriente. Las neuronas del MTN presentan un soma de tamaño grande, expresan canales de sodio sensibles a la tetrodotoxina y no presentan una joroba en la fase de repolarización del potencial de acción. Todas estas características están presentes en neuronas no nociceptivas. Las neuronas del MTN mostraron exclusivamente corrientes de adaptación rápida (RA) en respuesta a la estimulación mecánica. Para identificar los canales mecanotransductores específicos que median las corrientes RA en neuronas del MTN, estudiamos la expresión de algunas proteínas candidatas a ser mecanotransductores usando la técnica de PCR de célula única. Los resultados mostraron heterogeneidad en la expresión de las diferentes proteínas estudiadas: el 85 % de las neuronas expresaron TRPC5, el 47 % expresaron TRPC3, el 42 % TRPA1, el 25 % Piezo2, el 28 % TRPV4, el 7 % TRPV2 y el 13 % expresaron ASIC3. La expresión de estos canales iónicos fue confirmada por otras técnicas como la hibridación in-situ o de inmunohistoquímica. Una vez analizada la expresión de diferentes mecanotransductores, nos propusimos determinar la contribución de los canales iónicos TRPA1 y TRPC5 a la corriente activada por el estímulo mecánico en neuronas del MTN. La deleción genética del canal TRPA1 redujo significativamente la corriente mecánica e incrementó el umbral mecánico comparado con las neuronas de ratones C57BJ/L6. La eliminación del canal TRPC5 aumentó el umbral de activación de la corriente y la latencia, pero no modificó significativamente la amplitud de la corriente activada por el estímulo mecánico. Por último, analizamos el papel del canal mecanotransductor Piezo2. Para la eliminación del canal Piezo2 se usaron primero, un virus AAV con una secuencia shRNA contra Piezo2 y segundo, la eliminación genética especifica de su expresión en neuronas propioceptivas. Los registros eléctricos y mecánicos realizados mediante la técnica de patch clamp en ambos modelos animales, mostraron que la corriente mecánica en ausencia del canal Piezo2 en neuronas propioceptivas se redujo casi por completo. La eliminación selectiva del canal Piezo2 de las neuronas propioceptivas produjo una posición anormal de las extremidades y la realización de diferentes pruebas de comportamiento mostraron deficiencias severas en la coordinación de movimientos y la estabilidad de los ratones. En este trabajo, hemos mostrado que las neuronas propioceptivas responden a la estimulación mecánica mediante la activación de una corriente de entrada de adaptación rápida. Adicionalmente, hemos identificado la expresión de varios canales iónicos en las neuronas propioceptivas que podrían estar participando en la mecanotransducción de estas neuronas, sin embargo, la contribución más relevante de este trabajo es la identificación del canal Piezo2 como el principal mecanotransductor de los propioceptores en ratón.