Development of technological platforms for the identification of novel cellular modulators of FOXO activity

Resumo

FOXO proteins are evolutionarily conserved transcription factors implicated in several fundamental cellular processes, functioning as end-point for transcriptional programs involved in apoptosis, stress response and longevity. Abrogation of FOXO function is very frequent in human cancer, therefore the mechanisms of regulation of the FOXO proteins are receiving increasing attention in cancer research. The FOXO proteins integrate regulatory inputs from a variety of upstream signaling pathways, most importantly in response to growth factor and stress signaling. Recently, FOXO factors have been established as tumor suppressors, promoting the transcription of proapoptotic molecules like FasL and Bim when the PI3K/Akt pathway is downregulated. In order to reveal novel modulators of FOXO activity we developed several technological platforms suitable for high throughput screenings that allow for the specific identification of repressors of FOXO proteins. The U2foxRELOC system is based on U2-OS Osteosarcoma cells stably expressing a GFP-FOXO3A fusion protein that translocates to the cell nucleus upon FOXO activation. This High Content Screening (HCS) system was shown to be accurate for the detection of small compounds able to induce the translocation of the fusion protein between both cell compartments. The U2nesRELOC system allows for the detection of unspecific FOXO nuclear trapping via the inhibition of CRM-1/exportin, members of the nuclear export machinery. The 293foxREP system can be used to detect FOXO activation by monitoring FOXO-dependent luciferase expression. The high transfection efficiency of those cells makes them ideal for RNAi-based screenings. Finally, the U2transLuc system constitutes a breakthrough in the screening field, combining both fluorescence-based translocation analysis and luciferase light emissions in a single multiplexed assay, offering the advantages of both U2foxRELOC and 293foxREP in a single cell-based system. In parallel, a pathway deconvolution system was also developed. The BaFiso system contains genetically engineered BaF/3 cells that can be used for pathway dissection, defining whether the effects triggered by a given agent occur via Akt-dependent signaling. The five technological platforms which have been developed in the scope of this thesis can be used either for primary screenings or deconvolution, offering a wide choice of complementary readouts either for compound or RNAi screenings for novel FOXO modulators. Finally, we developed a large-scale RNAi and a chemical genetics screen, from which several novel FOXO associations were found including Calmodulin and the Drosophila homolog tribbles. We further validated and characterized these novel FOXO modulators. Las proteínas FOXO son una familia de factores de transcripción constituida por FOXO1, FOXO3A y FOXO6, que se encuentran conservados y están implicados en varios procesos celulares fundamentales. Funcionan como efectores de programas transcripcionales involucrados en apoptosis, respuesta a estrés y longevidad. La función de FOXO está frecuentemente desregulada en cáncer, con lo que la investigación de los mecanismos que regulan dichos factores de transcripción ha ganado relevancia. Las proteínas FOXO integran estímulos regulatorios de vías de señalización, sobre todo en respuesta a factores de crecimiento y estrés. Recientemente FOXO se ha establecido como supresor tumoral, promoviendo la transcripción de genes pro-apoptoticos como FasL y Bim en respuesta a la inhibición de la vía de señalización PI3K/Akt. Esto es lo que ocurre durante privación de factores de crecimiento o de nutrientes. Con objetivo de identificar nuevos reguladores de la función de FOXO hemos desarrollado plataformas tecnológicas adaptadas para rastreos de alto rendimiento. El sistema U2foxRELOC se basa en células de osteosarcoma U2-OS que expresan establemente una proteína de fusión, GFPFOXO3A, que se transloca al núcleo de las células cuando se produce la activación de FOXO. Este sistema de rastreo de alto contenido (HCS) se ha demostrado fiable para la detección de moléculas pequeñas capaces de inducir la translocación de FOXO entre ambos compartimentos celulares. El sistema U2nesRELOC permite la detección de la localización inespecífica de FOXO en el núcleo de las células como consecuencia de la inhibición de la maquinaria de exporte nuclear CRM1/exportina. El sistema 293foxREP puede ser utilizado para detectar la activación de FOXO a través de la monitorización de la expresión de luciferasa dependiente de transcripción inducida por FOXO. La alta eficiencia de transfección de estas células les hace ideal para rastreos basados en siRNA. Finalmente, el sistema U2transLuc combina el análisis de la translocación con luminiscencia dependiente de FOXO en un ensayo multiparamétrico, combinando las ventajas de cada uno de los sistemas U2foxRELOC y 293foxREP en un único sistema celular. Paralelamente hemos desarrollado un sistema de deconvolución, el sistema BaFiso, que contiene células BaF/3 modificadas genéticamente que pueden ser usadas para el análisis de vías de señalización específicas, definiendo si el efecto de un determinado agente ocurre a través de la señalización dependiente de Akt. Los cinco sistemas desarrollados pueden ser usados tanto para rastreos primarios como para deconvolución, y con ese amplio espectro de análisis hemos podido realizar rastreos de de genética química y de interferencia de RNA en los cuales hemos encontrado dos nuevos moduladores de la actividad de FOXO: Calmodulina y el homólogo de Drosophila tribbles, que han sido validadas y caracterizadas en el presente trabajo.