Improving the use of the sequential elution technique in terrestrial mosses

Resumen

INTRODUCCIÓN Es un hecho bien contrastado que los briófitos y los líquenes son unos excelentes biomonitores de la calidad del aire, especialmente de metales pesados (Tyler, 1989). Usualmente los trabajos existentes se centran en el estudio de la deposición de contaminantes para lo que se utiliza la determinación de sus contenidos totales. En la actualidad más de 30 países europeos emplean habitualmente esta técnica, ya sea en organismos sin lavar (p.e. Harmens et al., 2008), para evaluar la deposición atmosférica- o bien en organismos lavados (Markert et al., 1999) tratando de evaluar solamente los elementos teóricamente disponibles para el organismo. Sin embargo, en fechas recientes se han puesto de manifiesto ciertos problemas, que hacen que el uso que se le ha dado hasta el momento pueda ser inadecuado. Los principales problemas son dos: i) La difícil definición de las concentraciones determinadas en el musgo, ya que estas raramente se correlacionan con la deposición metálica, al tiempo que el lavado al que puede someterse al musgo es ineficiente. Por lo tanto el musgo no sirve para estimar la deposición metálica atmosférica ni permite, mediante el lavado, estimar los contaminantes biodisponibles y bioconcetrados por los musgos. ii) La variabilidad temporal de la concentración de los metales determinados en el musgo, tanto lavado como sin lavar es extremadamente alta. De esta forma la representatividad de las muestras es muy reducida, haciendo que el error asociado a las mismas sea muy elevado. Existe una alternativa a la determinación total, que es la cuantificación de elementos en las diferentes localizaciones celulares. La técnica empleada es la Técnica de Lavado Secuencial (Sequential Elution Technique, SET), que intenta solventar algunas de las desventajas descritas para la determinación de la concentración total. La definición de cada una de las localizaciones celulares que se obtiene con la SET es muy precisa y facilita las interpretaciones toxicológicas de los resultados. Sin embargo, los datos sobre la concentración total de los contaminantes son más difíciles de interpretar si no se obtienen como la suma de las diferentes fracciones analizadas con la SET. Mediante esta técnica se puede obtener un mayor conocimiento sobre la biodisponibilidad de los contaminantes y los riesgos asociados, sobre la representatividad temporal de los contaminantes bioconcentrados; y sobre los efectos tóxicos de éstos. La SET permite cuantificar, mediante lavados sucesivos, los elementos presentes en los diferentes compartimentos celulares (Brown, 1995): i) intercelular (elementos solubles que bañan externamente la pared celular y la cara externa de la membrana plasmática sin ningún tipo de unión a las células y partículas depositadas sobre la superficie); ii) extracelular (elementos unidos a la pared celular y/o a la cara externa de la membrana plasmática); iii) intracelular (compuesta por los elementos presentes en el interior del citoplasma o dentro de orgánulos celulares, así como por elementos unidos a la cara interna de la membrana plasmática); y iv) material particulado (compuesto por partículas extracelulares y/o partículas insolubles correspondientes a depósitos cristalinos del interior de las células.). Los primeros ensayos para intentar determinar las concentraciones celulares de diferentes elementos fueron realizados por Brown y Slingsby (1972) trabajando con el liquen Cladonia rangiformis. Posteriormente la SET se fue perfeccionando y se empezó a utilizar con otras especies de líquenes (p.e. Beckett y Brown, 1984; Brown y Wells, 1988), de musgos acuáticos (p.e. Vázquez et al., 1999, Fernández et al., 2006) y de musgos terrestres (p.e. Bates, 1994; Fernández et al., 2004). Se fueron probando diferentes tiempos de lavado y diferentes extractantes extracelulares e intracelulares hasta establecer la técnica tal y como se conoce en la actualidad. El protocolo que se ha venido empleando con más asiduidad ha sido el propuesto por Brown y Wells en 1988. Con posterioridad se han propuesto pequeñas modificaciones al mismo, como la realizada por Vázquez et al. (1999), que han sido empleadas hasta el día de hoy. Aunque de forma tradicional no se ha realizado, es recomendable la determinación del contenido total en paralelo, para así poder comprobar si la suma de las fracciones es equivalente a dicho contenido total. Tras estas modificaciones el protocolo de extracción constaría de las siguientes etapas: i. Extracción intercelular: lavado de la muestra (aprox. 0.1 g peso seco) en 10 mL de agua bidestilada durante 30 seg en agitación. Retirada y secado del material para someterlo a la siguiente etapa de la SET y determinación analítica del extracto. ii. Extracción extracelular: se sumerge la muestra en 10 mL del medio de extracción, con agitación, en dos pasos sucesivos (45 min + 30 min), renovando el medio de extracción entre cada paso. Retirada y secado del material y determinación analítica del extracto. iii. Extracción intracellular: la muestra es secada hasta peso constante (45º C) para provocar la rotura de las membranas celulares, y se determina el peso seco. Posteriormente, el metal soluble intracelular se disuelve mediante agitación en 10 mL de HNO3 1N durante 30 min. Retirada del material y determinación analítica del extracto. iv. Fracción de material particulado: la muestra se seca hasta peso constante (45º C) y se determina dicho peso. Los metales residuales y las partículas insolubles se extraen o determinan directamente con el método seleccionado (p. e. extracción ácida). Determinación analítica. Recientemente, Pérez-Llamazares et al. (2009) han propuesto una nueva modificación que consiste en realizar las determinaciones de los contaminantes directamente en la muestra -y no en los extractos- previniendo de esta forma las interferencias analíticas que se pueden producir entre los elementos determinados y los extractantes utilizados (p.e. dimercaprol). Tras estas modificaciones el protocolo de extracción consistiría en las mismas etapas, pero comenzando siempre por una extracción total. La diferencia es que se emplearía el cuádruple de muestra, y en cada etapa (determinación total, i, ii y iii) se iría reservando una alícuota correspondiente a la cuarta parte de la muestra inicial, que posteriormente se homogeneizaría y analizaría. Los extractos líquidos obtenidos podrían ser desechados y las concentraciones correspondientes a cada fracción para los diferentes elementos se calcularían de la siguiente manera: - Fracción de material particulado: material determinado tras la etapa iii. - Fracción intracelular: restando a la concentración obtenida para las fracciones intracelular y particulada (material determinado tras la etapa ii), la concentración de material particulado (material determinado tras la etapa iii). - Fracción extracelular: restando a la concentración obtenida para las fracciones extracelular, intracelular y particulada (material determinado tras la etapa i) la concentración correspondiente las fracciones intracelular y particulada (material determinado tras la etapa ii). - Fracción intercelular: restando a la concentración total la concentración correspondiente a las fracciones extracelular, intracelular y particulada (material determinado tras la etapa i). En ambos protocolos, se recomienda realizar un mínimo de 3 réplicas para cada una de las extracciones para reducir la variabilidad asociada a los procesos de extracción. El musgo terrestre Pseudoscleropodium purum (Hedw.) M. Fleisch. ha sido empleado en todos los experimentos llevados a cabo en la presente Tesis. El empleo de los musgos terrestres como biomonitores de la calidad del aire se debe a que presentan numerosas características que les permiten tener una alta capacidad de intercambio catiónico, y de esa forma acumular sustancias que les pueden llegar de forma disuelta con las precipitaciones o en forma de material particulado. Esta especie ha sido elegida en concreto porque es frecuente en el área de estudio en la que se han realizado los diferentes experimentos, lo que permite una fácil recolección tanto para los estudios de laboratorio como para los desarrollados en el área de influencia de focos de emisión de contaminantes. 2. OBJETIVOS, PRINCIPALES RESULTADOS Y CONCLUSIONES Capítulo 2. Evaluación de cationes y agentes quelantes como extractantes extracelulares de Cu, Pb, V y Zn en la Técnica de Lavado Secuencial aplicada al musgo terrestre Pseudoscleropodium purum. Para seleccionar el mejor extractante extracelular de Cu, Pb, Va y Zn mediante la Técnica de Lavado Secuencial (Sequential Elution Technique, SET) en el musgo Pseudoscleropodium purum se llevaron a cabo 3 experimentos. En el primero se probaron diferentes concentraciones de los siguientes extractantes: CoCl2, NiCl2, Pb(NO3)2, SrCl2, dimercaprol, EDTA y penicilamina. Se eligió la concentración óptima de cada uno en base a la máxima extracción de Zn obtenida sin producir alteraciones en la permeabilidad de la membrana plasmática. En el segundo y tercer experimento, se evaluó la capacidad de dichos extractantes extracelulares (a la concentración óptima establecida) para extraer la fracción extracelular de Cu, Pb, V y Zn. Se recomienda la extracción con EDTA 10 mM para los 4 elementos considerados. Como segunda opción, se recomienda el uso de penicilamina 50 mM para la extracción de Cu, de dimercaprol 30 mM para la extracción de Pb y V y el uso de NiCl2 20 mM para la extracción de Zn. También se concluye que estos resultados no pueden ser extrapolados a otras criptógamas y que por tanto son necesarios ensayos separados. Capítulo 3. Búsqueda de un extractante extracelular de Hg para su uso en la Técnica de Lavado Secuencial con Pseudoscleropodium purum. Con el fin de encontrar un extractante extracelular óptimo para la extracción de Hg mediante la SET en el musgo Pseudoscleropodium purum, se estudió la eficiencia de varios cationes metálicos (CoCl2 50 mM, NiCl2 20 mM, Pb(NO3)2 30 mM y SrCl2 50 mM) y agentes quelantes (dimercaprol 30 mM, EDTA 10 mM y penicilamina 50 mM). Para ello se incubó el musgo en una alta concentración de Hg (40 ¿g L-1) durante una hora y, tras eliminar la fracción intercelular, se le sometió a la SET empleando los extractantes indicados. Los resultados obtenidos muestran que los agentes quelantes dimercaprol y penicilamina son los que desplazan un mayor contenido de Hg extracelular, probablemente debido a que ambos presentan en su estructura grupos -SH que tienen alta afinidad por el Hg. El dimercaprol sería el extractante recomendado porque logra desplazar hasta un 93% del metal extracelular. Este extractante fue luego empleado para la extracción de Hg en un gradiente industrial de contaminación con Hg, consiguiéndose una concentración extracelular del 80% respecto del total. De forma paralela, se propuso una nueva modificación de la SET, basada en la determinación de metales en musgo sólido y no en los extractos. Una ventaja que tiene esta modificación es que todas las determinaciones se realizan mediante la misma técnica analítica (mediante un analizador directo de mercurio) por lo que se minimizan los errores asociados al empleo de diferentes técnicas de la anterior versión de la SET. Se comprobó que la SET no siempre refleja la correcta ubicación de los metales dentro de la célula y por tanto sería aconsejable la utilización de otras técnicas complementarias que muestren la localización real del elemento estudiado. Capítulo 4. Técnica de Lavado Secuencial en el musgo Pseudoscleropodium purum: comparación entre el extractante extracelular comúnmente utilizado NiCl2 y otros nuevos extractante. La SET se utiliza para determinar la distribución de elementos en las diferentes fracciones celulares de los musgos. En esta técnica se emplean principalmente como extractantes extracelulares NiCl2 y EDTA, pero su uso presenta varios inconvenientes. Para tratar de evitar dichos problemas se han buscado unos nuevos extractantes que realicen el desplazamiento de metales ligados extracelularmente o por altas concentraciones (Ca) o por gran afinidad por los lugares de intercambio catiónico (Hg y Au). En el caso de los extractantes que desplazan por alta concentración, se probaron HCl, NaCl y CaCl2 como posibles alternativas para determinar las concentraciones metálicas extracelulares en el musgo Pseudoscleropodium purum. Se escogió CaCl2, puesto que sin alterar la permeabilidad de la membrana, es el que potencialmente tiene más éxito en la unión a los lugares de intercambio catiónico. La concentración elegida fue 160 mM, ya que sin producir alteraciones en la membrana, logra el máximo desplazamiento de Zn. Tras esta elección se realizaron dos experimentos para comprobar la eficiencia del Ca como extractante de Zn extracelular, tanto en condiciones de laboratorio como de campo En el otro caso, se probaron diferentes concentraciones de Hg y Au, puesto que ninguno de estos elementos ha sido empleado con anterioridad en la SET y ambos presentan unas características electrónicas que hacían suponer que eran elementos capaces de desplazar a otros cationes de los lugares de intercambio catiónico. Los resultados obtenidos muestran que debe descartarse la extracción de metales ligados extracelularmente por alta concentración de Ca, puesto que la extracción de Zn no ha sido total. Respecto al empleo de Hg y Au como extractantes, a bajas concentraciones provocan alteraciones de la membrana y aun obviando este hecho ninguno de ellos es más eficiente en la extracción de Zn que el extractante de referencia (NiCl2 20 mM). Capítulo 5. Evaluación de extractantes extracelulares en la Técnica de Lavado Secuencial mediante técnicas de microscopia electrónica. Para evaluar la eficiencia de la extracción de Zn en el musgo Pseudoscleropodium purum se han empleado paralelamente la SET y microscopía electrónica de barrido con microanálisis por energía dispersiva de rayos-X (SEM-EDX). El musgo fue recolectado en dos zonas, una contaminada situada en las cercanías de una siderurgia férrica en cuyo entorno hay altas concentraciones de Zn y otra no contaminada, que se empleará como control y para la realización de una incubación en una solución 30 mg L-1 de Zn. Se determinaron las concentraciones de Zn en las diferentes localizaciones celulares del musgo mediante la SET y se analizaron diferentes puntos en la superficie del musgo y en las partículas depositadas sobre él mediante SEM-EDX. Los resultados muestran que la fracción extracelular obtenida mediante la SET engloba tanto el Zn unido a los lugares de intercambio catiónico del musgo como el unido a las partículas que aparecen en la superficie del musgo, lo que se traduce en una sobreestimación de Zn extracelular. Después de la extracción extracelular no se detecta Zn ni en la superficie del musgo ni en las partículas. Para evitar los problemas asociados a la presencia de partículas sobre la superficie del musgo se debería emplear un sistema de lavado que eliminase dichas partículas antes de aplicar la SET. Otra alternativa sería usar la concentración intracelular pues no está influenciada por la carga metálica de las partículas y refleja mejor los efectos de los contaminantes en el metabolismo del musgo. Capítulo 6. Localización celular de K, Na, Cd y Zn en el musgo Pseudoscleropodium purum en un estudio a escala regional. En este trabajo se pretende comprobar si el empleo de la SET mejora la interpretación de los resultados de las concentraciones totales obtenidas en el musgo Pseudoscleropodium purum en una red regional, al aportar información sobre la localización celular, biodisponibilidad y representatividad temporal de diferentes elementos. Se muestrearon 147 estaciones localizadas en los vértices de una red de 15 x 15 Km UTM. Se determinaron las concentraciones total y extra e intracelular de K, Na, Cd y Zn y se analizó la estructura espacial mediante variogramas robustos. Los resultados muestran que mediante el empleo de la SET mejora la interpretación obtenida con la concentración total, observándose diferencias entre los elementos regulados o no metabólicamente. La concentración extracelular, pese a los problemas asociados a las partículas depositadas sobre la superficie del musgo, puede aportar información sobre posibles riesgos potenciales debido a la posible solubilización de dichas partículas y posterior absorción. Sin embargo, la concentración intracelular, además de no estar influenciada por la presencia de partículas en la superficie del musgo, suministra una información toxicológica más realista, ya que se puede relacionar con los procesos metabólicos del musgo. Por ello ser recomienda priorizar el empleo de la fracción intracelular a la hora de utilizar musgos en redes de vigilancia ambiental. INQUIETUDES Desde el origen de la SET han surgido diversos problemas, alguno de los cuales ya se han resuelto, pero aún siguen existiendo otros pendientes de resolución. Dentro de éstos pueden diferenciarse problemas de tipo metodológico, de resolución relativamente sencilla, y problemas inherentes a la propia SET de resolución más compleja. Los problemas de tipo metodológico se ciñen a aspectos concretos en la utilización de la SET que necesitan ser investigados en profundidad para permitir su estandarización. Entre ellos está la variabilidad de los propios procesos de extracción debido a la heterogeneidad de la muestra y los errores analíticos, que determinará el número de réplicas analíticas necesarias para obtener unos resultados menos sesgados. Hasta el momento, en la bibliografía disponible se comprueba que lo más habitual es el uso de 3 (p.e. Vázquez et al., 1999) o 5 réplicas (p.e. Branquinho et al., 1997; Pérez-Llamazares et al., 2009), sin que esta decisión haya sido justificada adecuadamente. Otro problema de índole metodológica, restringido a los briófitos terrestres, es la necesidad de la estandarización para cada especie del tiempo necesario para que, expuesto a una atmósfera saturada en humedad, exista la seguridad de que la permeabilidad de la membrana no esté alterada. La duración de este periodo es muy heterogénea en la bibliografía consultada, variando entre 24, 72 y 168 horas (Brumelis y Brown, 1997; Pérez-Llamazares et al., 2010; Pérez-Llamazares et al., 2009; respectivamente). Por otra parte, el número de contaminantes analizados hasta el momento mediante la SET es relativamente pequeño, por lo que faltaría comprobar si los extractantes habitualmente utilizados son adecuados para otros elementos que aún no se han analizado con la SET. Los problemas intrínsecos a la propia SET proceden todos del hecho de que las diferentes localizaciones celulares vienen definidas por las técnicas analíticas empleadas para su cuantificación. Si no existe una técnica analítica que permita aislar una determinada localización celular ésta deberá ser cuantificada conjuntamente con otra, aunque desde un punto de vista biológico puedan ser diferentes. Además no es sencillo comprobar ni la eficiencia de las extracciones ni si el elemento determinado realmente corresponde a la localización que se pretende cuantificar. Son pocas las investigaciones que se han realizado para la comprobación de la eficacia del proceso de extracción extracelular, pudiendo ser este tópico el que demande en la actualidad un esfuerzo investigador mayor. Así se hace necesario emplear simultáneamente otras técnicas diferentes para poder asegurar si la carga de metal es únicamente extracelular o no. Entre estas técnicas adicionales están técnicas de tipo histoquímico y la microscopía electrónica con microanálisis. Como ya se mencionó anteriormente, el problema es que las diferentes localizaciones celulares vienen definidas por las técnicas analíticas correspondientes. Al no existir una técnica que permita la determinación de forma exclusiva del material particulado que está depositado sobre la superficie del musgo, dado que no se conoce una técnica eficiente para eliminarlo, este permanece sobre ella interfiriendo con las sucesivas extracciones extracelulares y posiblemente intracelulares. Posteriormente, este material es cuantificado conjuntamente con el material particulado interior, que sí está realmente bioconcentrado y, por lo tanto, con una interpretación biológica muy diferente. Así se hace completamente necesario la investigación de un paso de limpieza/lavado previo que permita cuantificar de forma directa, o a través de una diferencia de concentración, el material particulado externo. La existencia de todos estos problemas puede ser una de las causas de que la SET no se utilice habitualmente, y que no se haya trasladado definitivamente a estudios de campo, a pesar de las mejoras que puede suponer respecto a un análisis convencional de la concentración total de briófitos o líquenes. Otra causa puede ser que la técnica no ha sido desarrollada para contamintantes que no sea metales, como aniones inorgánicos (p.e. fluoruros) y contaminantes orgánicos (p.e. PCDD/DFs, PAHs, PCBs, etc.). Esto limita la interpretación que pueda hacerse de su concentración total tal y como se ha venido realizando tanto en musgos como líquenes. Posiblemente, el mayor problema que exista en la actualidad es la posible sobreestimación de la fracción extracelular cuando la muestra contenga material particulado en la superficie externa de los organismos. Ante las desventajas que ofrece la cuantificación de la localización extracelular, la fracción intracelular parece tener grandes ventajas: i) podría no verse afectada por las partículas (si la extracción de metal por parte del extractante extracelular es totalmente eficiente); ii) permite la evaluación de riesgos ambientales; iii) representa en mayor medida las condiciones medias de contaminación a la que se ve sometido el organismo; y iv) permite una mejor evaluación de la fitotoxicidad, ya que ha sido relacionada con fotosíntesis y respiración en varios estudios (Brown y Sidhu, 1992; Branquinho et al., 1997). BIBLIOGRAFÍA Bates, J.W. 1994. Responses of the mosses Brachythecium rutabulum and Pseudoscleropodium purum to a mineral nutrient pulse. Functional Ecology 8, 686-692. Beckett, R.P., Brown, D.H. 1984. The control of cadmium uptake in the lichen genus Peltigera. Journal of Experimental Botany 35, 1071-1082. Branquinho, C., Brown, D.H., Catarino, F., 1997. 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