Análisis del complexoma de envuelta celular de bacterias gram-negativas mediante electroforesis nativa de alta resolución

  1. DIÉGUEZ CASAL, ERNESTO
unter der Leitung von:
  1. Sandra Sánchez Poza Doktormutter

Universität der Verteidigung: Universidade de Santiago de Compostela

Fecha de defensa: 26 von Juni von 2013

Gericht:
  1. Carlos M. Ferreirós Domínguez Präsident
  2. Miguel Blanco Álvarez Sekretär
  3. Cristina Madrid Xufré Vocal
  4. Sonia Eiras Penas Vocal
  5. Concepción Herrero Vocal
Fachbereiche:
  1. Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía

Art: Dissertation

Zusammenfassung

En las últimas décadas se han analizado numerosos proteomas bacterianos, tanto completos como fraccionados, y en este trabajo se planteó el análisis del complexoma de envuelta celular de tres bacterias Gram-negativas: E. coli, S. marcescens y N. meningitidis. Una proporción importante de las proteínas y complejos de la envuelta están embebidos en membranas, y presentan una elevada hidrofobicidad, lo cual limita su análisis mediante las técnicas electroforéticas habituales, especialmente cuando la intención es preservar la interacción de los componentes de los complejos. En ese sentido, la técnica electroforética utilizada en este trabajo, la ¿high resolution Clear Native Electrophoresis¿ (hrCNE) aúna ventajas de técnicas previas, utilizando una combinación de detergentes que evitan la disociación de los complejos proteicos pero permiten también su separación. Esta técnica fue combinada, además, con la del ¿cross-linking¿ químico, que también permite la estabilización de las interacciones proteicas. Los objetivos de este trabajo, por tanto, fueron el estudio del complexoma de envuelta celular de las tres bacterias citadas, con la caracterización de sus complejos proteicos y componentes, y el desarrollo de un procedimiento experimental que combinase el ¿cross-linking¿ con la hrCNE. El complexoma de la envuelta de E. coli y S. marcescens fue analizado mediante hrCNE, tanto de modo unidimensional (1D hrCNE) como bidimensional, en condiciones nativas (2D hrCNE/hrCNE) o desnaturalizantes (2D hrCNE/SDS-PAGE), con el objetivo de obtener información tanto de los complejos proteicos como de sus componentes. Ambos fueron analizados, posteriormente, mediante espectrometría de masas (LC-MS/MS y MALDI-TOF/TOF). La evaluación de los resultados confirmó que la hrCNE es una técnica con un alto potencial de separación y caracterización de complejos proteicos, tal y como se había observado previamente en trabajos con N. meningitidis. Asimismo, el análisis bidimensional nativo (2D hrCNE/hrCNE) demostró que los principales complejos proteicos sensibles al tipo de detergente no iónico utilizado en la hrCNE son los complejos de porinas, la citocromo ubiquinol oxidasa y la ferritina. Se evidenció, además, que nuestros resultados son coherentes con trabajos previos con OMVs de bacterias Gram-negativas, puesto que fueron detectadas proteínas no sólo de membrana externa, sino también de membrana interna, periplasma y citoplasma, así como proteínas relacionadas con el material genético. Fueron detectados, asimismo, y por primera vez en gel en el caso de E. coli, los dos componentes del complejo HflCK, y se describió una posible nueva interacción entre la porina OmpF y la proteína DLDH, tanto para E. coli como para S. marcescens. En ambos casos fueron detectados un elevado número de componentes del metabolismo energético. Es necesario recalcar que para S. marcescens se trató del primer análisis proteómico de envuelta celular llevado a cabo. Por tanto, muchas proteínas fueron detectadas en gel por primera vez, incluyendo los componentes de una importante bomba de eflujo, SdeXY, que participa en la eliminación de numerosos antibióticos, así como de dos componentes del complejo YaeT, esencial en el ensamblaje de proteínas en la membrana externa. En relación a la combinación del ¿cross-linking¿ químico con la hrCNE, los análisis fueron realizados sobre E. coli, S. marcescens y N. meningitidis, y el agente de ¿cross-linking¿ químico heterobifuncional Sulfo-SBED se describió compatible con la hrCNE, y podría convertirse en una herramienta útil en la detección de componentes minoritarios de complejos proteicos. Finalmente, consideramos que debido a la gran variabilidad de parámetros utilizados en los estudios proteómicos, sería necesaria cierta estandarización, si bien la integración de los datos obtenidos mediante diferentes estrategias de análisis proteómico podría generar un mayor conocimiento de sus proteomas y complexomas.